Metabolitos Secundarios

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    12-Dec-2015

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<ul><li><p>34</p><p>TEMA 8: PRODUCCIN INDUSTRIAL DE METABOLITOSSECUNDARIOSDr. Pedro F. Mateos</p><p>I. METABOLITOS SECUNDARIOSDE INTERES INDUSTRIAL</p><p>Los metabolitos secundarios sonmolcu las s in te t i zadas pordeterminados microorganismos,normalmente en una fase tarda de suciclo de crecimiento, cuyascaractersticas son:</p><p>(i) No son necesarios para elcrecimiento del microorganismo quelos produce. En estado natural, susfunciones se hallan ordenadas a lasupervivencia de la especie, perocuando los microorganismos que losproducen se desarrollan en cultivo purolos metabolitos secundarios nodesempean esa misin.</p><p>(ii) Generalmente se producen comomezclas de productos muyrelacionados qumicamente entre s.Por ejemplo, una nica cepa de unaespecie del gnero Streptomycesproduce 32 antraciclinas diferentes.</p><p>Diferentes tipos de tetraciclinas</p><p>(iii) Cada uno de estos productos esproducido por un grupo muy reducidode organismos.</p><p>(iv) La produccin puede perdersefcilmente por mutacin espontnea(degeneracin de la raza), por lo queson muy importantes las tcnicas de</p><p>c o n s e r v a c i n d e e s t o smicroorganismos.</p><p>De todos los productos tradicionalesobtenidos por fermentacin, los msimportantes para la salud humana sonlos metabolitos secundarios. Donde seincluyen, adems de los antibiticos,ciertas toxinas (micotoxinas),alcaloides (cido lisrgico), factores decrecimiento vegetal (giberelinas) ypigmentos.</p><p>Los metabolitos secundarios mejorconocidos son los antibiticos, de losque se han descubierto ms de 5000,cifra que aumenta a razn de unamedia aproximada de 300 por ao,aunque la mayora carecen de utilidadpues son txicos para los organismosvivos. Aproximadamente el 75% de losantibiticos conocidos son producidospor actinomicetos. Algunas especiesson excepcionales productores deantibiticos, por ejemplo Streptomycesg r y s e u s produce al menos 40antibiticos diferentes.</p><p>II. RELACIONES ENTRETROFOFASE - IDIOFASE</p><p>En el metabolismo secundario las fasesde crecimiento se denominan trofofase,fase de crecimiento logartmico dondenormalmente no se producen losmetabolitos secundarios, e idiofase,fase estacionaria donde normalmentese producen los metabolitossecundarios. Aunque es unasimplificacin pensar slo en dosfases, esta simplificacin nos permitecomprender mejor la fermentaccinindustrial de los metabolitossecundarios. Es decir, si nosotros</p></li><li><p>35</p><p>queremos producir un metabolitosecundario primero debemos asegurarlas condiciones apropiadas durante latrofofase para un buen crecimiento ydespus, debemos alterar esascondiciones en el momento adecuadopara asegurar una excelente produccindel metabolito secundario.</p><p>Relacin entre trofofase e idiofase</p><p>Este retraso en la formacin demetabolitos secundarios es uno de losprincipales mecanismos mediante elcual los microorganismos productoresde antibiticos evitan el suicidio,puesto que al comienzo de la faselogartmica de crecimiento sonsensibles a su propio antibitico, paraposteriormente, durante la idiofase,volverse resistentes al antibitico queestn produciendo.</p><p>Los factores que ponen en marcha laproduccin de metabolitos secundariosal final de la trofofase no se conocen;nicamente se sabe que estemecanismo se dispara normalmentecuando algn nutriente del medio se haagotado. En algunas ocasiones elnutriente responsable es una fuente deCarbono, en otras, sin embargo es elNitrgeno o el Fsforo. La explicacin</p><p>puede ser que al faltar nutrientes sealteren los metabolitos primarios y seoriginen inductores de los enzimasencargados de la sntesis de losmetabolitos secundarios. Otraexplicacin puede ser que al faltar lafuente de Carbono cesa la represinpor catabolito, sintetizndose a partirde este momento los enzimasnecesarios para la biosntesis de estosmetabolitos secundarios.</p><p>Cualquiera que sea el mecanismogeneral por el que se dispara elmetabolismo secundario al final de latrofofase, es un hecho que en estepunto hay unos cambios muy fuertesen la composicin enzimtica de lasclulas, apareciendo los enzimas queestn especficamente relacionados conla formacin de metabolitossecundarios. Sin embargo, eindependientemente de este aspectogeneral del metabolismo secundario, seha puesto de manifiesto la existenciade sistemas de regulacin que jueganun papel importante en la sntesis dedeterminados productos industriales.</p><p>III. EFECTO DE LOSPRECURSORES</p><p>Las manipulaciones, tanto del mediode cultivo como de las condicionesambientales que se llevan a cabodurante el screening secundario de unaforma sistemtica, incluyen la adicinde centenares de aditivos en los mediosde cultivo que puedan actuar comoposibles precursores del producto queestamos investigando. Ocasionalmentese encuentra un precursor queincrementa de forma notable laproduccin de este metabolitosecundario. El precursor puede inclusodirigir la sntesis de un determinadoproducto de entre varios que seproducan anteriormente; es lo que seconoce como biosntesis dirigida.</p></li><li><p>36</p><p>Como ejemplos de precursores estn elcido fenilactico en el caso de laproduccin de bencil penicilina;determinados aminocidos especficosen la produccin de actinomicinas ytirociclinas; cidos benzoicossustituidos en la formacin denovobiocinas.</p><p>Precursores de metabolitos secundarios</p><p>En muchas fermentaciones, sinembargo, los precursores no muestranninguna actividad. Esto es debido aque su sntesis por el microorganismono es el factor limitante de laproduccin del metabolito secundario.En estos casos, la adicin de aditivosha revelado efectos dramticos, tantoestimuladores como inhibidores en laproduccin del metabolito secundariopor parte de una molcula noprecursora. Este efecto se debenormalmente a la interaccin de estoscompuestos con los mecanismosreguladores del microorganismo</p><p>productor. Precisamente, estudiandoestos efectos se puso de manifiesto quelos mecanismos reguladores de losmicroorganismos ejercen un efectonotable en la produccin de losmetabolitos secundarios.</p><p>IV. INDUCCION ENZIMATICA</p><p>A lo largo de los estudios sobre elpapel que el triptfano juega comoestimulador de la biosntesis dealcaloides por Claviceps (Cornezuelodel centeno) se puso de manifiesto quela induccin enzimtica juega un papelimportante en la produccin demetabolitos secundarios.</p><p>Si bien el triptfano es un precursor enla biosntesis de estos alcaloides, no esun factor limitante; ya que su efectoestimulador se debe en gran parte a lainduccin de la sntesis de los enzimasque dan lugar a la sntesis de losalcaloides. Existen tres razones quehan llevado a esta conclusin:</p><p>(i) Los anlogos del triptfano, que nose incorporan a la molcula delalcaloide, es decir, que no sonprecursores, estimulan la produccinde los alcaloides.</p><p>(ii) El triptfano se debe aadir durantela trofofase ya que si se aade durantela idiofase tiene poco efecto.</p><p>(iii) El triptfano aadido es absorbidopor la clula durante la fase decrecimiento y alcanza su mayorconcentracin intracelular justo antesde la sntesis de los alcaloides.</p><p>Otro efecto de induccin similar es elde la metionina en la biosntesis decefalosporina por Cephalosporiuma c r e m o n i u m . A pesar de que lametionina provee azufre al antibitico,la estimulacin de la formacin de</p></li><li><p>37</p><p>cefalosporina C se debe a un efecto deinduccin. Se lleg a esta conclusinya que la metionina debe aadirsedurante la trofofase; adems, lametionina puede ser reemplazada porsu anlogo norleucina que no tieneazufre en su molcula, por lo que suefecto no puede ser debido al hecho deaportar azufre.</p><p>La induccin tambin juega un papelmuy importante en determinar larelacin entre los componentes de lamezcla que se produce en unafermentacin. Por ejemplo, en lafermentacin para la produccin dees t r ep tomic ina s e p roducees t rep tomic ina y mans idoestreptomicina. La conversin demansido es t reptomicina enestreptomicina se cataliza mediante elenzima a -D-manosidasa que esinducido por manano.</p><p>Inductores de metabolitos secundarios</p><p>V. REGULACION PORRETROALIMENTACION</p><p>La regulacin por retroalimentacintambin parece jugar un papelfundamental en el metabolismosecundario. Por ejemplo, elcloranfenicol al igual que lacicloheximida, penicilina y otrosantibiticos limitan su propiap r o d u c c i n a c t u a n d o p o rretroalimentacin generalmente sobreel primer enzima de la ramificacinque conduce a la sntesis de estemetabolito.</p><p>Otro caso de regulacin porretroalimentacin sucede cuando laruta metablica ramificada, mediantela cual se sintetiza el metabolitosecundario, conduce a su vez a lasntesis de un metabolito primario,como es el caso de la lisina y lapenicil ina en P e n i c i l l i u mchrysogenum. En un primer momentose encontr que la L-lisina disminua laproduccin de penicilina, pero no sesaba porqu; hasta que se descubrique el a -aminoadipato es unintermediario en la biosntesis de losdos, lisina y penicilina. La disminucinen la formacin de penicilina por lisinaest causada por la inhibicin porretroalimentacin de la homocitratosintasa, que es el primer enzima en labiosntesis de lisina.</p><p>Otro camino mediante el cual acta laregulacin por retroalimentacin en laformacin de metabolitos secundariosimplica la inhibicin y la represin delas fosfatasas por fosfato. Muchasfermentaciones se inhiben porortofosfato (H3PO4) a concentraciones(&gt;10 mM) que no son inhibidoras parael crecimiento. En algunos casos seexplica ya que los intermediarios de laruta metablica del producto que nosinteresa estn fosforilados, aunque el</p></li><li><p>38</p><p>producto final no lo est. Lasfosfatasas actuaran en estosintermediarios.</p><p>Un ejemplo lo tenemos en labiosntesis de estreptomicina dondeactan varias fosfatasas en laformacin de estreptidina y en elltimo paso, desfosforilacin de laestreptomicina fosfato, donde elenzima que cataliza esta reaccintambin est inhibida por el fosfatoinorgnico.</p><p>Biosntesis de estreptomicina</p><p>VI. REGULACION CATABOLICA</p><p>La represin catablica fue observadaen la industria de antibiticos muchoantes de que se conociera y seentendiera el significado general deeste fenmeno. Durante el desarrollode la produccin de penicilina seobserv que la glucosa, que era unamagnfica fuente de carbono para elcrecimiento del microorganismo, eraun sustrato muy malo para laproduccin de penicilina; sin embargo,se observ que la lactosa, que soportaun crecimiento muy pobre, es un buensustrato para la produccin depenicilina. Por lo tanto, el medioclsico de Jarvis y Johnson lleva unamezcla de glucosa y lactosa.</p><p>Produccin de penicilina</p><p>Los mecanismos moleculares de laregulacin catablica se esclarecieronen la dcada de los 70. Hoy sabemosque la regulacin catablica estmediada por el nivel intracelular de unnucletido especial, el monofosfatocclico de adenosina (AMPc), cuyonivel intracelular es inverso a laconcentracin de glucosa en el mediode cultivo. Mientras existe glucosa enel medio de cultivo el nivel intracelularde AMPc es sumamente reducido,debido a que la glucosa inhibe laactividad adenilciclasa, enzima queinterviene en la sntesis de AMPc.Cuando la glucosa del medio se agota,la concentracin intracelular de AMPcaumenta rpidamente. El AMPcsintetizado forma un complejo con unaprotena existente en la clula,denominada "protena receptora deAMPc". Este complejo de protenareceptora y AMPc acta sobre el genpromotor al objeto de inducir lasntesis de los enzimas necesarios parala utilizacin de otras fuentes decarbono distintas a la glucosa. Laglucosa inhibe gran cantidad demetabolitos secundarios: cidogiberlico, cido lisrgico, penicilina,</p></li><li><p>39</p><p>cefalosporina,cloranfenicol, bacitracinaactinomicina.</p><p>La represin catablica tambin juegaun papel importante en ladeterminacin de la concentracinrelativa de cada uno de los antibiticosde una misma familia qumica que seproducen en una fermentacin. Este esel caso de la produccin deestreptomicina por Streptomycesgryseus. Como ya hemos dicho, elmanano es el inductor de lamanosidasa que convierte la mansidoestreptomicina en estreptomicina; sinembargo, este enzima no se sintetiza sihay glucosa (&gt;0,5%) en el mediodebido a la represin catablica. Slocuando la glucosa ha desaparecido seproduce el enzima que es inducido pormanano. En este caso la represincatablica juega un papel fundamentalen el porcentaje de mansidoestreptomicina producido en estafermentacin.</p><p>VII. REGULACION POR ELESTADO O CARGA ENERGETICA</p><p>La produccin de clortetraciclina sereduce en gran cantidad cuando existefosfato inorgnico en el medio. En lasfermentaciones para la produccin declortetraciclina, la idiofase comienzacuando se agota el fosfato en el medio.Puesto que en la biosntesis declortetraciclina donde intervienen 72intermediarios, ninguno de ellosfosforilado, este efecto del fosfato nose debe a la regulacin porretroalimentacin de fosfatasas. Sinembargo, es posible que estaregulacin est mediada por la cargaenergtica ya que el contenido en ATPde dos cepas de S t r e p t o m y c e saureofaciens, una poco productora(200 g/mL) y la otra muy productora(2000 g/mL) de clortetraciclina,</p><p>difieren en que la cepa menosproductora tiene de 2 a 4 veces msATP que la ms productora. En ambascepas la concentracin de ATPaumenta en la trofofase y disminuye enla idiofase, durante la produccin declortetraciclina.</p><p>VIII. INCREMENTO DE LAPRODUCCION DE METABOLITOSSECUNDARIOS</p><p>La mayora de los controles descritosen este captulo se eliminan mediantemanipulacin ambiental o mediante laobtencin de mutantes mal regulados.</p><p>1.- Manipulacin ambiental</p><p>Catabolito: eliminacin de la glucosadel medio.</p><p>Induccin : adicin de manano almedio.</p><p>Carga energtica: disminucin defosfato en el medio.</p><p>Precursores: adicin de precursores almedio.</p><p>2.- Seleccin de mutantes malregulados</p><p>A. Revertientes</p><p>La estrategia consiste primeramente enseleccionar las mejores cepasproductoras del antibitico. Estas cepasse someten a mutacin con un agentemutgeno (UV, luz ultravioleta o NTG,nitrosoguanidina). De los mutantesobtenidos se seleccionan aquellos queno sean productores del antibitico (seseleccionan aquellas cepas que poseenuna protena inactiva). Estos mutantesse vuelven a someter a mutacin y seseleccionan aquellas cepas que sean denuevo productoras del antibitico (se</p></li><li><p>40</p><p>obtienen mutantes dobles desreguladosen un gen en el que acta esa protenainactiva).</p><p>Revertientes superproductores</p><p>B. Resistencia a anlogos</p><p>La estrategia es la misma que ladescrita con los metabolitos primarios.Aunque en este caso el metabolitosecundario debe compartir la rutabiosinttica con un metabolitoprimario.</p><p>Mutantes superproductores resitentes aanlogos</p><p>C. Mutasntesis</p><p>Se realiza mediante la mutacin en elgen que codifica para un precursor delantibitico natural, con lo que seconsigue la sntesis de una molcula deantibitico incompleta. Cuando seaade al medio el precursor que nopuede sintetizar el microorganismo,ste reanuda la produccin delantibitico natural. De esta manera sepueden obtener nuevos antibiticossimplemente aadiendo precursorescon estructuras ligeramente diferentes.</p><p>Mutasntesis</p><p> + UV - NTG ++C1----------&gt;C1.1-----------&gt;C1.2</p><p> _____ P1 /</p><p> P1 /A------&gt;B----- \ \_____ P2</p></li></ul>

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