INFORME TECNICO FINAL - ?· INFORME TECNICO FINAL PROYECTO “Caracterización genética de poblaciones…

  • Published on
    12-Jan-2019

  • View
    212

  • Download
    0

Transcript

INFORME TECNICO FINAL

PROYECTO Caracterizacin gentica de poblaciones de Nothofagus obliqua(Mirb. et Oerst.) y Nothofagus alpina (Poepp. et Endl.) Oerst. (=N. nervosa (Phil.) Dim.

et Mil.) mediante marcadores moleculares e isoenzimticos

Convenio IICA BID ATN/SF 6486 RG

Lder del Proyecto: Dr. Mario Paredes

Junio 2003

Programa Cooperativo para el Desarrollo Tecnolgico Agroalimentario y Agroindustrial del Cono Sur

Argentina,Brasil, ChileParaguay, Uruguay

BoliviaInstituto Interamericanode Cooperacin parala Agricultura

Caracterizacin gentica de poblaciones de Nothofagus obliqua (Mirb.etOerst.) y Nothofagus alpina (Poepp.et Endl.) Oerst. (=N.nervosa (Phil.) Dim. et

Mil.) mediante marcadores moleculares e isoenzimticos

Informe Tcnico Final de Proyecto

FONDO REGIONAL DE TECNOLOGIA AGROPECUARIA(FONTAGRO)

Instituto de Investigaciones Agropecuarios, INIACRI, Quilamapu, Chile

Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria, INTAEEA Bariloche, Argentina

Junio de 2003

PARTICIPANTES

Director del ProyectoMario Paredes C, Ing. Agr. Ph.D.CRI Quilamapu, INIA, Chilln, Chile

Director AlternoLeonardo Gallo, Ing. For., Dr.EEA INTA Bariloche, Argentina

Instituciones responsables del proyecto

Investigadores, CRI Quilamapu, INIA, Chilln, ChileViviana Becerra, Ing. Agr. Msc.Rodrigo Avils, Ing. Civil, IndustrialCarmen Rojo, Ing. Agr.

Investigadores, EEA, INTA, Bariloche, ArgentinaPaula Marchelli, Dr.Mara Marta Azpillicueta, Ing. For.Paula Crego, Lic. Biol.

Instituciones asociadas, Chile

Gustavo Moreno, Ing. For., Corporacin Nacional Forestal (CONAF), Chilln, Chile.Roberto Ipinza, Ing. For., Dr. Instituto Forestal, (INFOR), Concepcin, Chile.Braulio Gutierrez, Ing. For., Instituto Forestal, (INFOR), Concepcin, Chile.Mara Paz Molina, Ing. For., Instituto Forestal, (INFOR), Concepcin, Chile.Oriana Ortiz, Centro For., (CEFOR), Valdivia, Chile.

Institucin asociada, Argentina

Administracin de Parques Nacionales, Argentina

TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN EJECUTIVO......................................................................................................................1

IDENTIFICACIN Y COLECTA DE POBLACIONES DE N. alpina Y N. Obliqua EN CHILE Y

ARGENTINA ........................................................................................................................................3

DIVERSIDAD Y DIFERENCIACIN GENTICAS DETECTADA CON MARCADORES

ISOENZIMTICOS EN RAUL...........................................................................................................13

DIVERSIDAD Y DIFERENCIACIN GENTICA DETECTADA CON MARCADORES

ISOENZIMTICOS EN ROBLE .........................................................................................................27

CARACTERIZACIN GENTICA DE NOTHOFAGUS OBLIQUA Y N. ALPINA MEDIANTE

RAPD .................................................................................................................................................38

DIFERENCIACIN GENTICA DETECTADA CON MARCADORES DE ADN DE

CLOROPLASTO ................................................................................................................................52

CONSERVACIN DE SEMILLA DE MEDIOS HERMANOS Y ESTABLECIMIENTO DE

ENSAYOS DE PROGENIE................................................................................................................57

DESARROLLO DE NUEVAS TECNOLOGAS..................................................................................64

IMPACTOS ESPERADOS.................................................................................................................65

ACTIVIDADES DE COORDINACIN Y DIFUSIN..........................................................................67

BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................................................70

ANEXOS ............................................................................................................................................73

1

RESUMEN EJECUTIVO

El objetivo principal del Proyecto fue evaluar la variabilidad gentica de roble y raulmediante el uso de marcadores moleculares (RAPDs, cpADN) e isoenzimticos para lafijacin de criterios de conservacin, mejoramiento gentico, reforestacin, manejo yaprovechamiento.

Los objetivos especficos planteados para el proyecto fueron:

identificar y diferenciar genticamente procedencias de N. nervosa y N. obliqua; evaluar la variabilidad gentica de roble y raul chileno y argentino a travs de

marcadores bioqumicos (isoenzimas) y de roble y raul chileno y argentino medianteel uso de marcadores moleculares (RAPD y cpADN);

determinar niveles y direccin de introgresin en los hbridos naturales formados porN. nervosa y N. obliqua (isoenzimas);

asociar la informacin gentica con la distribucin geogrfica de las especies ypoblaciones;

disponer de semilla de medio hermanos para un futuro establecimiento de ensayos deprogenie;

disponer de un banco de semillas de las poblaciones argentinas de ambas especies.

En Chile, la colecta de poblaciones se realiz utilizando una seleccin de sitios basado enantecedentes de variacin climtica, distribucin geogrfica, lmites fitogeogrficos yvariacin genecolgica observable.

En Argentina, la metodologa utilizada en lo que respecta a recoleccin de semilla a nivelpoblacional se realiz con redes colocadas en las poblaciones, previamente a la cada delos frutos. La cosecha de familias de medio hermanos para su utilizacin en el anlisis decontrol gentico y ensayos de progenie se realiz con ayuda de prtigas, cosechando losfrutos a partir del rbol madre. Los estudios de laboratorio se realizaron a travs detcnicas de electroforesis horizontal en gel de almidn (isoenzimas) y mtodo PCR-RFLPpara los anlisis moleculares (cpADN).

Los objetivos planteados para la componente Argentina se cumplieron segn los plazosestipulados por el Proyecto. El grado de ejecucin de los mismos con respecto al estudiode las poblaciones Argentinas super lo planificado originalmente ya que se analiz unnmero mayor de poblaciones.

En lo referente a nuevas tecnologas desarrolladas, y en el marco del Convenio INRA-INTA se desarrollaron en el Laboratoire de Gntique et Amlioration des ArbresForestiers, Cestas, INRA, Francia un set de SSRs para Nothofagus. En dicho Instituto seprobaron y caracterizaron los nuevos primers, as como la transferibilidad de los SSRsdesarrollados para Quercus (europeos y americanos), gnero emparentado. Lapotencialidad de este marcador radica en su futura aplicacin en estudios de flujo gnico,necesarios para entender la estructura gentica hallada a partir de este Proyecto en laspoblaciones argentinas de ambas especies.

La difusin de los conocimientos generados a partir del Proyecto se llev a cabo a travsde publicaciones cientficas, captulos en libros tcnicos, presentaciones en Congresos eInformes Tcnicos (Anexo 1 ).

Los resultados obtenidos muestran en el lado argentino para ambas especies una altadiferenciacin gentica entre poblaciones relativamente cercanas dentro de una misma

2

cuenca lacustre. La diversidad gentica, en cambio, mostr patrones de variacindiferentes para ambas especies. Mientras que en Raul la mayor diversidad gentica seobserv en las poblaciones argentinas ubicadas al Oeste en Roble las poblaciones conmayor diversidad se encontraron al Este. La distribucin geogrfica de los haplotipos deADN de cloroplasto muestra en general una variacin latitudinal para ambas especies enArgentina y longitudinal en Chile. El anlisis conjunto de ambos tipos de marcadorespermiti la identificacin de reas prioritarias para la conservacin (segn criteriosgenticos) a partir de lo cual surgieron pedidos oficiales a las autoridades competentes encada caso para la recategorizacin, en el caso de reas de jurisdiccin de ParquesNacionales y pedido de declaracin como rea de reserva, en el caso de bosque depropiedad privada, como as tambin la identificacin de zonas de transferencia de semillapara el futuro manejo silvcola de la regin. Dada la importancia y alcance de losresultados obtenidos, la continuidad en los estudios posibilitara una mayor profundizacinen el conocimiento y entendimiento de las causas que modelan y modelaron la estructuragentica actual de estos bosques, brindando de esta manera la posibilidad de contar conmayor nmero de herramientas para la formulacin de estrategias de conservacin ymanejo para dichas reas.

Las restricciones y limitantes encontradas para el desarrollo del proyecto se relacionaroncon la recoleccin del material de estudio. En el lado Argentino no pudo realizarse unacosecha individual de 10 rboles por poblacin tal como estaba planeado originalmente yaque no hubo disponibilidad de fondos para tal fin. Por este motivo se opt por lametodologa de cosecha descripta arriba que fue ejecutada con fondos de INTA y de laAdministracin de Parques Nacionales. Por otro lado, las muestras de ADN depoblaciones chilenas que deban ser analizadas en Argentina (variacin en ADN decloroplasto) presentaron fallas en la amplificacin. Se debi recurrir entonces a muestrasobtenidas en plntulas ubicadas en el vivero de INTA EEA Bariloche generadas a partir deuna muestra incompleta de semillas enviadas por el INFOR. Por este motivo el anlisis deADN de cloroplasto se pudo realizar con slo 11 poblaciones chilenas de Raul (estabanplanificadas 22) y 9 poblaciones chilenas de Roble (estaban planificadas 23).

3

IDENTIFICACIN Y COLECTA DE POBLACIONES DE N. alpina Y N. Obliqua ENCHILE Y ARGENTINA

INTRODUCCIN

El mayor conocimiento cientfico y el aprovechamiento productivo del bosque de roble yraul en Chile y Argentina implica la necesidad de identificar y colectar poblacionesrepresentativas de su distribucin geogrfica.

En Chile, estas dos especies representan un total de 1.672.475 hectreas, de las cuales1.234.732 hectreas son renovales, 429.536 hectreas son de bosques adultos y 8.207hectreas son de bosque achoaparrado. En Argentina, el roble y el raul ocupan unasuperficie aproximada de 55.000 has, distribuidas en forma interrumpida en una regin deaproximadamente 1 milln de has.

En Chile, el roble, se encuentra distribuido en la Cordillera de Los Andes, desdeColchagua (3430 de Lat. S), por el norte y hasta la zona de Llanquihue (X regin), por elsur. En la Cordillera de la Costa, crece entre los cerros La Campana, El Roble y LaCampanita (V regin), por el norte hasta la zona de Osorno (X regin), por el sur(Donoso, 1994). En su lmite norte, en la Cordillera de Los Andes, se encuentra entre los1.000 y 2.000 metros de altitud, en cambio en la zona norte de la Cordillera de la Costa,habita entre los 850 y 2.220 metros de altitud, en exposiciones sur y sureste. A medidaque el bosques andino se desplaza hacia el sur se va haciendo ms continuo y se vareduciendo su presencia en altura, desde alturas mayores a los 1000m hasta los 600m(Donoso, 1994). El raul, es una de las especies nativas ms valiosas. En la Cordillera delos Andes se encuentra distribuida desde el sur del ro Teno (VII regin) hasta Valdivia (Xregin), partir de los 500 metros de altitud. En la Cordillera de la Costa esta especie seencuentra presente desde la ribera norte del ro Itata (VIII regin) hasta Valdivia, en laspartes altas hasta los 1.200 metros de altitud (Donoso, 1978).

En Argentina, el raul se distribuye a lo largo de numerosas cuencas lacustres de origenglaciario en sentido oeste-este. Esta especie se ubica en forma continua en un rangolongitudinal que va desde los 3925a los 4035Lat. Sur y en altitud desde los 600 hastalos 800 m, mientras que el roble se presenta en forma fragmentada entre los 3649y los4011S y desde los 800m hasta los 1000 m de altura. Ambas especies se distribuyendentro de un rango de precipitaciones de 3.000 a 1.200 mm (Gallo et al., 2000).

La amplia variedad de ambientes en que se desarrollan estas especies hace suponer unagran variabilidad gentica que es necesario estudiar y capturar. Por lo tanto, los objetivosde esta etapa del proyecto fueron: 1) Identificar y colectar poblaciones de roble y raul quesean representativas de su diversidad gentica; 2) Proveer de material gentico para losestudios bioqumicos, moleculares y ensayos de progenie; y 3) Conservar parte de estematerial gentico en Bancos de germoplasma.

COMPONENTE CHILENO

Materiales y Mtodos

La primera etapa, incluy un estudio de la distribucin geogrfica del roble y raul paraseleccionar las poblaciones a incluir en este proyecto. Para la identificacin de laspoblaciones se utilizaron datos de variacin climtica latitudinal y altitudinal, distribucingeogrfica actual de las poblaciones, lmites fitogeogrficos y variacin genecolgicaobservable (Vergara et al, 1998).

4

Resultados

Los antecedentes recopilados permitieron distinguir tres macroclimas: centro-norte, centroy sur. En el macroclima centro-norte se identific solo una regin de procedencia de roble,en cambio, en el macroclima centro se identificaron seis regiones de procedencia de robley tres procedencias de raul y en el macroclima sur se detectaron 7 regiones deprocedencia de roble y cuatro de raul, lo que totaliz 14 regiones de procedencia de robley 7 de raul (Cuadro 1 ).

Cuadro 1. Distribucin de regiones de procedencia

Regiones de ProcedenciaMacroclima

Roble Raul

Centro - Norte 1-C

Centro 2-C 3-C * 6-D * 8-A 9-A 10-A 3-C * 8-A 9-A

Sur 4-C 5-C * 7-D * 11-A 12-A 13-A 14-A 5-C * 11-A 13-A14-A

La distribucin geogrfica fue dividida en macroclimas (centro-norte, centro, sur), regionesde procedencia (14 en roble y 7 en raul), y procedencia y puntos de colecta (39 en roble y18 en raul) (Fig. 1 ). Finalmente, los puntos de muestreo o poblaciones cosechadasdentro de cada zona de procedencias se caracterizaron en funcin del sitio, bosque y anivel individual.

5

Fig. 1: Delimitacin de regiones de procedencia

Posteriormente, en roble, se identificaron 39 procedencias o poblaciones o puntos demuestreo y para el caso de raul, se determinaron 8 poblaciones. Cada poblacin sedescribi su ubicacin geogrfica: regin, provincia, comuna y ubicacin especfica(Cuadro 2 ).

6

Cuadro 2: Ubicacin de puntos de muestreo o poblaciones

Especie Regin Poblaciones REG PROV COM LUGAR 1.Til-Til RM Chacabuco Til-Til Cuesta La Dormida 2. Lampa RM Chacabuco Lampa Roblera de Lampa

1-C

3. Alhue RM Melipilla Alhue El Membrillo 4. Alto colorado VI Card. Caro Pichilemu Alto Colorado 5. R. N. Los Ruiles VII Cauquenes Cauquenes Los Ruiles 6.1 Ninhue VIII uble Ninhue Cerro Curahun

2-C

6.2 Quirihue VIII uble Quirihue Quirihue 7. Cayumanqui VIII Concepcin Quilln Cerro Cayumanqui 8. Curanilahue VIII Arauco Curanilahue San Jos de Colico 9. L. Lanalhue VIII Arauco Caete Cam. Caete-Purn

3-C

10. Pichipillahun IX Malleco Galvarino Pichipillahun11. Cuesta Lastarria IX Cautn Loncoche San Antonio4-C12. Cruces X Valdivia Valdivia Sector Cayumapu13. Llancacura X Valdivia La Unin Trumao14. Rio negro X Osorno Ro Negro Ro negro

5-C

15. Purranque X Osorno Purranque Cam.Purranque-Frutillar16. Victoria IX Malleco Victoria Inspector Fernndez6-D17. Quepe IX Cautn Freire Quepe18. Malalhue X Valdivia Lanco Puruln19. Futrono X Valdivia Futrono Futrono

7-D

20. Rupanco X Osorno P. Octay Hacienda Rupanco21. Sierras de Bellavista VI Colchagua San Fernando Sierras de Bellavista22. Alto Lircay VII Talca San Clemente Altos de Lircay23. Altos de Vilches VII Curic Molina Altos de Vilches24. Vilches VII Talca San Clemente Vilches

8-A

25. Bullileo VII Linares Parral Bullileo26. R. Nac. uble VIII uble Recinto Las Trancas27. Ralco VIII Bio-Bio Santa Brbara Camino Ralco-Pangue28. Recinto VIII uble Pinto Cam.Pinto-Recinto km.10

9-A

29.Sta. Brbara VIII Bio-Bio Santa Brbara Parcela 4310-A 30. Loncopu, Arg.

31. L. Galletue IX Malleco Melipeuco Icalma32. Cunco IX Cautn Cunco Lomacura33. L. Colico IX Cautn Cunco Puerto Puma

11-A

34. Curarrehue IX Cautn Curarrehue Puesco35. P. Pino Hachado, Arg12-A36. Alumin, Arg.37. Choshuenco X Valdivia Panguipulli Puerto Fuy13-A38. Llifn X Valdivia Futrono Llifn

Roble

14-A 39. Lago Lacar, Arg. 1. Quebrada Bellavista VII Colchagua San Fernando Sierras de Bellavista 2. Cord. Nahuelbuta Vlll Bio-Bio Nacimiento Los Guindos

3-C

3. Pichipillahun IX Malleco Galvarino Pichipillahun 4. Las trancas X Valdivia La Unin Cam. Trumao-Hueicolla5-C 5. Huellusca X Osorno Purranque Huellusca 6. Radal 7 Tazas VII Curic Molina Radal 7. Vilches VII Talca San Clemente Vilches

8-A

8. Emb. Bulileo VII Linares Parral Bullileo 9. Recinto VIII uble Pinto Los Lleuques - Atacalpo10. Sta. Brbara VIII Bio-Bio Santa Brbara El huachi

9-A

11.Jauja IX Malleco Collipulli Jauja12. Malalcahuello IX Malleco Curacautn Malalcahuello13. Melipeuco IX Cautn Melipeuco El Manzano

11-A

14. Curarrehue IX Cautn Curarrehue Puesco15. Releco X Valdivia Panguipulli Releco16. Neltume X Valdivia Panguipulli Neltume

13- A

17. Arquilhue X Valdivia Futrono Llifn

Raul

14-A 18. Lago Lacar, Arg.

En la figura 2 , se ilustra la posicin de cada punto de muestreo en el plano de regionesde procedencia, para ambas especies.

7

Fig. 2: Mapa de regiones de procedencias, puntos de muestreo para anlisis demarcadores genticos

La descripcin de cada poblacin se presenta en el Cuadro 3 para roble y en el Cuadro 4para raul.

8

Cuadro 3. Descripcin de los puntos de muestreo de roble

Punto PosicinGeogrfica

Posic.Fisiogrfica

Exposicin FrecuenciaSemilleros

Estructuradel bosque

N rboles/ha Tipo deRegeneracin

EstadoProductivo

Posicinsocial

1.Til-Til CCor LA S.E. B RSD 600 MM AS, SM C

2. Lampa CCor LM S.E. N RA 400 MM Nula

3. Alhue CCoc LB S.O B AA MM BS D

4. Alto colorado CCoc LB O B BAS 400 MM BS D

5. R. N. Los Ruiles CCoc LM N B RA y BAS 300 MM AS, SM D,C

6.1 Ninhue CC.or LA S y SE B RA 400 MA AS, SM D y C

6.2 Quirihue CCor LA S M RSD 550 MM AS D y C

7. Cayumanqui CC.or LM y LA E M RSD y RA 500 y 300 MA SM D,C e I

8. Curanilahue CC.or LM y LA S y E B RA 200 MA SM D Y C

9. L. Lanalhue PL VA A RSD y RA 500 y 350 MA A D y C

10. Pichipillahun CCor LM S.O B RA 350 MM AS,SM D,O

11. Cuesta Lastarria CCor LM S M BAS 150 MM AS D,O

12. Cruces PL VA M RA 240 MA SM D y C

13. Llancacura CC.or LM y VA E A BAS Y CN 240 MA M D y C

14. Rio negro DI VA A BAS y RA 330 MA SM D y C

15. Purranque DI VA A AS y BAS 280 MA AS D

16. Victoria DI VA M RSD y CN 400 MM SM D,C,O

17. Quepe DI VA A RA 250 MM AS D

18. Malalhue DI LM E y O A RSD 600 MM SM D y C

19. Futrono DI VA A RA y AA 330 MA AS D y C

20. Rupanco DI VA M RA 225 MM AS D,O,A

21. Sierras de Bellavista CA LM N B BAS y AA 100 MM BS D,C,O

22. Alto Lircay CA LA N.O B RSD 550 MM BS D,C

23. Altos de Vilches CA LM O B RSD 550 MM BS C,O

24. Vilches PCA LB O B BAS 350 MM SM D,C,O

25. Bullileo CA LM S B RA 350 MM SM D,O

26. R. Nac. uble PCA LM E M RA y BAS 330 MA SM D y C

27. Ralco CA,oc LM y VA O y NO M RA y BAS 330 MA SM D,C y A

28. Recinto PCA VA M RSD 625 MM SM D,C y O

29.Sta. Brbara PCA VA A RA y RSD 240 y 625 MA SM D,C y O

30. Loncopu, Arg.

31. L. Galletue CA LM N B RSD y BA 450 MM BS D,C,A

32. Cunco PCA VA B BAS y AA 200 MM SM D,C,O

33. L. Colico PCA LB S.O B BAS y AA 300 MM SM D,O

34. Curarrehue CA LM E M BAS y AA 250 MM SM D,C,A

35. Paso Pino Hachado, Arg

36. Alumin, Arg.

37. Choshuenco CA LM S.E. M RSD 450 MM AS D

38. Llifn CA VA M RA 300 MM AS D,O

39. Lago Lacar, Arg.

9

Cuadro 4. Descripcin de los puntos de muestreo de raul

Punto PosicinGeogrfica

Posic.Fisiogrfica

Exposicin FrecuenciaSemilleros

Estructuradel bosque

N rboles/ha Tipo deRegeneracin

EstadoProductivo

Posicinsocial

1. Quebrada Bellavista

2. Cord. Nahuelbuta CC LM y LA E B RSD 500 MM SM D,C y O

3. Pichipillahun CCor LM S M BAS y CN 200 MM AS,SM D,O

4. Las trancas CC LM SE y E M RSD 400 MM SM D y O

5. Hueyusca CC LB SE y S M DSD 400 MM SM D,C y O

6. Radal 7 Tazas CCoc LM S.S.E M RSD 400 MM SM D,O

7. Vilches CCoc LM N B RSD 450 MM BS D,C

8. Emb. Bulileo CCoc LM S.O B RSD 450 MM AS D,A

9. Recinto CA oc LM y LB S Y SE M RSD 400 MM SM D,C y O

10. Sta. Brbara DI VA A RSD 625 MM AS D,C y O

11.Jauja PCA LM N.O B RSD 550 MM SM D,C

12. Malalcahuello CA LM S B AA MM BS A

13. Melipeuco CA LM S B RSD 600 MM BS AD

14. Curarrehue CA LM E B BAS y AA 250 MM SM D,O

15. Releco PCA LA O B RSD 400 MM SM D,O,A

16. Neltume CA LM S.E B RSD 400 MM BS D

17. Arquilhue CA LM O N BAS y AA 200 MM nula D,C

18. Lago Lacar, Arg.

Descripcin del Sitio

Posicin geogrfica del punto: describe la posicin geogrfica del punto dentro de laseccin transversal de la geografa chilena, de acuerdo con la siguiente clasificacin:Planicies litorales (PL); Cordillera de la Costa, ladera occidental; Cordillera de la Costa,ladera oriental (C.C.occ); Depresin Intermedia (D.I); Precordillera Andina (PCA);Cordillera Andina (C.A).

Posicin fisiogrfica del punto: describe la posicin del rodal donde se colect semilladentro de la topografa del paisaje, de acuerdo a la siguiente pauta: Cumbre (CU); Laderaalta (LA); Ladera media (LM); Ladera baja (LB); Valle (VA).

Exposicin: describe la exposicin predominante de la ladera en que se encuentra elpunto de colecta.

Frecuencia de semilleros: define la proporcin de rboles con semilla dentro del rodal, deacuerdo con la siguiente pauta: Alta: ms del 50% de los individuos del rodal presentansemillas (A); Media: entre el 10 y 50% de los rboles del rodal presentan semillas (M);Baja: menos del 10% de los rboles del rodal presentan semillas (B); Nula: no seobservan rboles con semilla en el rodal (N).

Descripcin del Bosque

Estructura: se define considerando la estructura original de los bosques de Nothofagus ysu condicin actual. Lo anterior los clasifica en renovales (bosques de segundocrecimiento) y bosque adulto, informacin que se complementa con su situacin dedensidad y de regeneracin. Adicionalmente se consideran algunas estructurasadicionales que escapan a esta clasificacin.

10

RD: Renoval Denso: bosque de segundo crecimiento con una densidad superior a los830 arb/ha, que presenta un estrato dominante de especies de Nothofagus.Corresponde a un rodal coetneo con regeneracin de especies tolerantes.

RSD: Renoval semidenso: bosque de segundo crecimiento que evidencia distintosgrados de intervencin que han reducido su densidad a un rango entre 400 y 830rboles por hectrea. Presenta mayor regeneracin en el sotobosque.

RA: Renoval abierto: bosque de segundo crecimiento que evidencia una considerablereduccin de su densidad por efecto de intervenciones (raleo, floreo u otras).Conserva la estructura de renoval, la coetaneidad de los individuos y la presencia deNothofagus en el estrato dominante.

BA: Bosque adulto: condicin del bosque en que la estructura representa estadossucesionales avanzados, con presencia de especies tolerantes y semitolerantes en elestrato codominante e incluso dominante. En esta situacin los rboles de roble y/oraul se presentan con un distanciamiento mucho mayor, con pocos individuos porhectrea (menos de 100), los que pueden manifestar una condicin de rbolesemergentes o dominantes en el perfil vertical.

BAS: Bosquetes aislados: corresponde a grupos de rboles separados de un rodalcontinuo, como consecuencia de la fragmentacin del rodal original. En la prcticacorresponden a pequeos bosquetes de proteccin o sombreadores para ganado.

AA: Arboles aislados: corresponde a los ltimos individuos remanentes de rodales queya no existen. Presentan un nulo o muy escaso grado de agrupacin con otros rbolesde la misma especie. Es el caso tpico de robles individuales aislados en medio decampos ganaderos o agrcolas.

CN: Cortinas naturales: corresponde a rboles que permanecen como remanentes deun rodal original, que fueron conservados intencionalmente en una arreglo lineal paracumplir funciones de delimitacin de potreros, servir como proteccin, cercos, etc.

Densidad media: representa una estimacin del nmero de rboles por hectrea,existente en el rodal desde donde se colect la semilla

Tipo de regeneracin: describe el tipo de regeneracin que origin al rodal desde dondese colecta la semilla. Monte bajo: Rodal generado mediante algn sistema natural depropagacin vegetativa, fundamentalmente rebrotes de tocn y de raz (MB); Monte alto:Rodal generado por una estrategia de reproduccin sexual (semillas)(MA); Monte medio:Rodal generado por una combinacin de las estrategias anteriores (MM).

Descripcin de los individuos cosechados

Estado productivo del rbol: entrega informacin respecto de la cantidad de semillas quepresenta cada rbol cosechado. Corresponde a una evaluacin subjetiva que considera lafacilidad con que se obtienen las semillas desde el rbol seleccionado, se clasifica en lostres niveles siguientes: Alta Semillacin: rboles con una alta densidad de cpulas en sucopa que permiten obtener con relativa facilidad la cantidad de frutos requeridos por elestudio (AS); Semillacin Moderada: baja cantidad de cpulas en el rbol, por lo que laobtencin de las semillas requeridas se logra con dificultad (SM); Baja Semillacin: pocadensidad de cpulas por rbol, lo que dificulta o impide conseguir el volumen de semillasplanificado (BS)

11

Posicin Social: describe la posicin de los rboles cosechados dentro de la estructuravertical de los estratos del rodal. Se utiliza la clasificacin tradicional (Dominantes,codominantes, intermedios y suprimidos) y se combina con la posicin de los rboles alinterior o en los linderos del rodal. Arboles dominantes (D); Arboles Codominantes (C);Arboles Intermedios (I); Arboles suprimidos (S); Arboles aislados (A); Arbol orillero (O).

Toda la semilla colectada en la temporada 1999/2000 y 2000/2001 fue identificada yseleccionada en el laboratorio para ser viverizada en invernadero para la obtencin deplantas para los ensayos de progenie y las muestras de hojas para la caracterizacinmolecular (RAPD y cpADN).

En la temporada 2002/2003 se procede a realizar una tercera colecta, pero esta vez solose incluy un punto de muestreo por zona de procedencia, en roble como en raul(Cuadros 5 y 6 ).

Cuadro 5. Zonas de procedencia y puntos de muestreo para roble

Zona de procedencia Punto de muestreo1C Cerro el Roble, Til Til2 C Quirihue3 C Lago Lanalhue4 C Cuesta Lastarria5 C Llancacura6 D Quepe7-D Malalhue8 A Vilches9 A Recinto11 A Cunco, Melipeuco13 A Choshuenco, Neltume

Cuadro 6. Zonas de procedencia y puntos de muestreo de raul

Zona de procedencia Punto de muestreo3 C Cord. De Nahuelbuta5 C Llancacura8 A Vilches9 A Sta. Brbara11 A Melipeuco13 A Neltume, Remeco

Parte de esta colecta est almacenada en el Banco de Germoplasma del CRI Quilamapu,INIA, Chilln.

COMPONENTE ARGENTINA

Ver captulo: Conservacin de semilla de medios hermanos y establecimiento de ensayosde progenie.

CONCLUSIONES

La Zonificacin propuesta y la cosecha de semillas efectuada permiti contar con unvalioso material de investigacin que posibilit cuantificar variabilidad gentica medianteisoenzimas y marcadores moleculares y en pruebas de progenie. Una parte de lasprocedencias colectadas se almacen en el Banco de Germoplasma del INIA Quilamapu.

12

El trabajo de Regiones de Procedencias, permiti ordenar rpidamente el complejo devariacin de las especies, definir un sistema de muestreo continuo y generar zonas demejoramiento en forma prctica y manejable.

La colecta de material gentico (semilla) constituy un gran esfuerzo debido a que estasespecies de Nothofagus presentan aersmo (aos de buena y mala produccin desemilla) por lo cual fue necesario realizar esta labor en varios aos.

13

DIVERSIDAD Y DIFERENCIACIN GENTICAS DETECTADA CON MARCADORESISOENZIMTICOS EN RAUL

INTRODUCCIN

El raul (Nothofagus alpina=N. nervosa) es una especie de alto valor econmico debido ala calidad de su madera. A pesar de esta situacin, se observa una reduccin de las reasde distribucin de la especie, con la consecuente prdida de variabilidad gentica(Vergara y Bohle, 2000) es producto de largo proceso de alteraciones y degradaciones desu potencial natural, producto de actividades de sustitucin, intervenciones de carcterdestructivo, como floreo y habilitacin de terrenos para uso agrcola y ganadero. Paraenfrentar esta situacin es necesario implantar medidas adecuadas que permitan obtenerpautas de utilizacin, considerando el valor econmico, funcin social, ecolgica yproductiva de la especie.

Para la formulacin de una poltica de conservacin y aprovechamiento de estos recursosgenticos es indispensable tener un conocimiento bsico de la variabilidad y de laestructura gentica de las especies. La informacin bsica sobre la organizacin de ladiversidad gentica de los Nothofagus en estudio, su distribucin geogrfica, la posibleasociacin entre ambas y la posible presencia de razas o hbridos, podra servir de basepara fijar criterios sobre plantacin, coleccin, conservacin, manejo y aprovechamientoracional de estas especies. Esta informacin sobre diversidad gentica es bsica paraapoyar tambin a los programas de mejoramiento gentico de estas especies.

Estudios realizados en Chile y en Argentina sobre algunas especies de Nothofagusindican que existe bastante variabilidad fenotpica en algunas caractersticasmorfolgicas, anatmicas y qumicas, de emergencia y crecimiento de plntulas. Estosestudios han determinado tambin que, en algunos casos, esta variacin fenotpica estasociada con factores geogrficos como son latitud y altitud. Una de las desventajas deluso de caracteres morfolgicos en estudios de variabilidad gentica es que generalmenterepresentan solo una pequea parte de la variacin gentica presente en el genoma de laespecie y estn influenciados por el medio ambiente. De esta situacin, se desprende laimportancia de complementar la informacin morfolgica con otro tipo de estudios quereflejen con mayor claridad la variacin gentica presente en la especie.

Los anlisis de isoenzimas han demostrado ser un medio prctico de resolver diferentesproblemas en gentica de poblaciones de rboles forestales y cultivos perennes comovariacin gentica de poblaciones centrales y marginales (Tigerstedt 1973, Guries y Ledig1982, Kertadikara y Prat 1995), variacin gentica entre y dentro de las poblaciones(Guries y Ledig 1982, Loukas y otros, 1983, Stavrakakis y Loukas 1983, Takahashi y otros1994, Beaver y otros, 1995) variacin gentica entre poblaciones cultivadas y silvestres(Ouazzani y otros 1993), estructura gentica y sistemas de pareamiento en poblacionesnaturales (Gallo y otros 1997) y Nothofagus (Haase, 1993). Aunque la variacinelectrofortica detectable en isoenzimas es slo una pequea fraccin de la diversidadgentica de la poblacin, y ella puede o no predecir la variacin de genes que controlanprocesos fisiolgicos o ecolgicamente importantes.

Un estudio realizado en 22 poblaciones naturales de raul en Chile, usando 10 sistemasenzimticos (GOT, ACP, AAP, PGI, SKDH, MNR, MDH, PER, LAP, CAT), detect un altoporcentaje de loci polimrficos (86%), las frecuencias allicas tuvieron un comportamientosimilar a otras especies estudiadas, con algunos alelos en alta y otros en baja frecuencia,y con un rango de alelos/locus de 2 a 4, un alto porcentaje de consanguinidad lo queredund en una deficiencia de heterocigotos. Al separar la variabilidad gentica de las

14

poblaciones se encontr un alto porcentaje de la diversidad gentica dentro de lapoblacin en comparacin a entre las poblaciones y una relacin entre la similitudgentica y la distribucin geogrfica de las poblaciones estudiadas (Pineda, 2000).

Los objetivos de este trabajo fueron: 1) Determinar el control gentico de algunossistemas isoenzimticos; y 2) Usar esta informacin para estudiar la estructura genticade esta especie.

COMPONENTE CHILENO

Materiales y mtodos

En Chile, se analizaron seis procedencias de raul representativas de las macroregionescentro y sur del pas (Cuadro 1 ).

Cuadro 1. Macroclima, regin de procedencia y poblaciones de raul utilizadas en elanlisis isoenzimtico

Macroclima Regin deprocedencia Poblacin

Centro 3 C Nahuelbuta8 A Vilches9 A Sta. Brbara

Sur 5 C Cord. Nahuelbuta11 A Neltume13 A Melipeuco

15

Fig 1. Ubicacin geogrfica de las procedencias de roble y raulevaluadas en el estudio

Los sistemas isoenzimticos analizados fueron ADH, IDH, MDH, PGI, GOT y SKDH.Estos sistemas fueron seleccionados por su buena resolucin y consistencia en lostrabajos realizados por el INTA. Una parte de este trabajo se realiz en el INTA parahomologar la tecnologa (procedimientos y lectura de los geles).

Anlisis estadstico

Los datos de isoenzimas fueron usados para estimar varios estadgrafos de variacingentica como: nmero de alelos por locus, porcentaje de diversidad gnica, porcentajede heterocigocidad, coeficiente de polimorfsmo (PIC), coeficiente de consanguinidad.Estos estadgrafos fueron calculados por locus y como promedio de la poblacin. Ademsde estos valores se calcularon las frecuencia allicas, varianza y la desviacin estndarpor locus y las frecuencias allicas por poblacin. Con estas frecuencias allicas se

16

pueden distinguir los alelos que se encuentra en una alta frecuencia como aquellos aleloscon baja frecuencia, considerados raros a nivel de toda la poblacin.

Para determinar la similitud entre las procedencias estudiadas se calcul la distanciagentica de acuerdo entre pares de procedencias utilizando la distancia gentica de Nei(1973). Estos valores fueron usados posteriormente para confeccionar un dendrograma,utilizando el mtodo de UPGMA para visualizar las relaciones genticas entre laspoblaciones evaluadas. Para estudiar la estructura gentica de las procedenciasevaluadas se realiz un anlisis de varianza para determinar la importancia de suscomponentes. De esta manera se pudo apreciar los porcentajes de variacin entre ydentro de las poblaciones.

Resultados

El anlisis de los datos isoenzimticos indic que todos los sistemas ADH, IDH, PGI yGOT presentaron una buena resolucin, con excepcin del sistema SKDH que presentproblemas de resolucin y consistencia en las muestras en las poblaciones analizadas porlo que se resolvi no incluirlo del anlisis.

Entre los sistemas que presentaron una buena resolucin ADH, IDH y PGI presentaronuna sola zona de tincin en comparacin con el MDH que present dos zonas de tincindenominadas MDH-B y MDH-C y GOT que present tres zonas, llamadas GOT-A, GOT-By GOT-C (Cuadro 2 ).

Cuadro 2. Parmetros de variacin gentica para 8 loci enzimticos en 6poblaciones chilenas de Notophagus alpina .

Tamao Nmero Diversidad CoefLoci

muestra alelos GnicaHeterocigocidad PIC

consanguinidadADH 200 2 0.057 0.027 0.055 0.534IDH 200 2 0.128 0.137 0.120 -0.070MDH-B 200 3 0.611 0.053 0.529 0.914MDH-C* 200 1 - - - -.PGI 200 3 0.080 0.028 0.077 0.655GOT-A 200 3 0.457 0.242 0.399 0.473GOT-B 200 5 0.323 0.292 0.300 0.099GOT-C 200 4 0.125 0.115 0.122 0.085Media 200 2.88 0.223 0.112 0.200 0.501*Monomorfico

Las isoenzimas utilizadas detectaron 23 alelos y un promedio de 2,9 alelos por loci. Elsistema que detect un mayor nmero de alelos fue el GOT, ya que con sus tres zonas detincin se pudieron visualizar 12 alelos. Dentro de este ltimo sistema, GOT-B detect 4alelos, GOT-C 4 alelos y GOT-C 3 alelos. Los sistemas MDH, PGI detectaron 4 y 3 alelos,respectivamente y los sistemas ADH y IDH detectaron solo 2 alelos cada uno de ellos(Cuadro 2 ).

El promedio de diversidad gentica obtenido fue de 0.22, sin embargo se observarondiferencias entre los sistemas isoenzimticos evaluados. El sistema isoenzimtico quedetect mayor diversidad gentica fue GOT con sus tres zona de tincin, GOT-A (0.46),GOT-B (0.32) y GOT-C (0.13), seguido de MDH-B (0.61). Por otro lado, los valores maspequeos fueron de ADH (0.06), PGI (0.08) IDH (0.13) (Cuadro 2 ).

17

El nivel de heterocigocidad promedio fue de un 0.11. El sistema isoenzimtico que detectmayor heterocigocidad fue GOT-B (0.29), GOT-A (0.24) y GOT-C (0.12). El nivel deheterocigocidad en los restantes sistemas isoenzimticos fue bajo y fluctu entre 0.03 y0.14 (Cuadro 2 ).

El contenido de polimorfismo, reflejado en el PIC present un valor promedio de 0.20, conun mayor valor en MDH-B (0.53) seguido de GOT-A (0.40), GOT-B (0.30) y GOT-C (0.12)(Cuadro 2 ).

El coeficiente de consanguinidad promedio fue 0.50, con valores muy variablesdependiendo del sistema isoenzimtico. Es as como, el valor mas alto de consanguinidadse obtuvo con MDH-B (0.91), seguido de PGI (0.66), ADH (0.53) y GOT-A (0.47). El restode los valores fluctuaron entre 0.07 y 0.10. Se present solo un valor negativo (Cuadro2).

Al analizar los loci en las seis poblaciones de raul, se pudo detectar diferentesfrecuencias allicas en los 23 loci. Es as como, a excepcin de MDH-C que fuemonomrfico, la mayor frecuencia allica estuvo representada por el alelo 2 de ADH(0.97), el alelo 1 de PGI (0.96), el alelo 2 de GOT-C (0.93) y el alelo 4 de IDH (0.93). Losalelos menos frecuentes o raros fueron detectados en el alelo 4 de GOT-B y el alelo 3 deGOT-C con un 1%. La desviacin estndar de las frecuencias allicas fue bastantepequea (Cuadro 3 ).

Cuadro 3 - Frecuencias allicas de 23 loci en 5 poblaciones chilenasde Notophagus alpina

Frecuencia DesvoLoci Alelos

allicaVarianza

estndarADH 1 0.03 0.0001 0.01ADH 2 0.97 0.0001 0.01IDH 3 0.07 0.0002 0.01IDH 4 0.93 0.0002 0.01MDH-B 1 0.14 0.0008 0.03MDH-B 2 0.42 0.0015 0.04MDH-B 3 0.44 0.0015 0.04MDH-C 1 1.00 0.0000 0.00PGI 1 0.96 0.0002 0.02PGI 2 0.00 0.0000 0.00PGI 3 0.04 0.0002 0.01GOT-A 1 0.07 0.0003 0.02GOT-A 2 0.69 0.0008 0.03GOT-A 3 0.23 0.0006 0.03GOT-B 1 0.13 0.0003 0.02GOT-B 2 0.81 0.0005 0.02GOT-B 3 0.03 0.0001 0.01GOT-B 4 0.01 0.0000 0.01GOT-B 5 0.02 0.0001 0.01GOT-C 1 0.04 0.0001 0.01GOT-C 2 0.93 0.0002 0.01GOT-C 3 0.01 0.0000 0.01GOT-C 4 0.02 0.0000 0.01

18

El anlisis de las frecuencias allicas por poblacin indic que los alelos que estuvieronpresentes en una mayor frecuencia en el anlisis general por loci (alelo 2 de ADH (0.97),el alelo 1 de PGI (0.96), el alelo 2 de GOT-C (0.93), y el alelo 2 de IDH (0.93)), no sedetectaron diferencias entre las poblaciones del macroclima Centro y del Sur, es decir,estos alelos estuvieron tambin presentes en una alta frecuencia en las poblacionesanalizadas (Cuadro 4 ).

Cuadro 4 - Frecuencias allicas de 23 loci enzimticos por poblacin de N. alpina

A11 A13 A8 A9 C3Melipeuco Neltume Vilches Santa Barbara Nahuelbuta

Loci Alelon=40 n=40 n=40 n=40 n=40

ADH 1 0.00 0.12 0.00 0.03 0.00ADH 2 1.00 0.88 1.00 0.97 1.00GOT-A 1 0.01 0.21 0.13 0.00 0.00GOT-A 2 0.74 0.67 0.79 0.76 0.53GOT-A 3 0.25 0.13 0.09 0.24 0.47GOT-B 1 0.06 0.17 0.02 0.17 0.20GOT-B 2 0.94 0.83 0.66 0.83 0.80GOT-B 3 0.00 0.00 0.17 0.00 0.00GOT-B 4 0.00 0.00 0.05 0.00 0.00GOT-B 5 0.00 0.00 0.11 0.00 0.00GOT-C 1 0.00 0.11 0.06 0.03 0.00GOT-C 2 1.00 0.89 0.81 0.97 1.00GOT-C 3 0.00 0.00 0.06 0.00 0.00GOT-C 4 0.00 0.00 0.08 0.00 0.00IDH 3 0.19 0.06 0.00 0.03 0.07IDH 5 0.81 0.94 1.00 0.97 0.93MDH-B 1 0.24 0.11 0.04 0.30 0.00MDH-B 2 0.33 0.54 0.41 0.37 0.48MDH-B 3 0.44 0.36 0.55 0.33 0.52MDH-C 1 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00PGI 1 1.00 0.86 1.00 0.98 1.00PGI 2 0.00 0.00 0.00 0.02 0.00PGI 3 0.00 0.14 0.00 0.00 0.00

En el caso de los alelos raros o con una baja frecuencia, se observ una diferencia enlas poblaciones del macroclima centro y sur. Por ejemplo, en la poblacin Vilches sedetect la presencia de cuatro alelos propios de esta poblacin (alelo1 y 5, GOT-B, alelo 3y 4 GOT-C) y en la poblacin Santa Brbara se detect un alelo especfico (aleleo 2 dePGI), todos ellos en un bajo porcentaje (Cuadro 5 ). Por otro lado, en la poblacin Neltumese detect el alelo 3 de PGI. Esta situacin indica una mayor presencia de alelosespecficos en las procedencias ubicadas en el macroclima centro comparada con elmacroclima sur (Cuadro 5 ).

19

Cuadro 5 - Presencia y frecuencia de alelos especficos pormacroclima y procedencia

Macroclima centro Macroclima surLoci, N alelo

Vilches Sta. Brbara Nahuelbuta Melipeuco NeltumeGOT-B, 4 0.05 0.0 0.0 0.0 0.0GOT-B, 5 0.11 0.0 0.0 0.0 0.0GOT-C, 3 0.06 0.0 0.0 0.0 0.0GOT-C, 4 0.08 0.0 0.0 0.0 0.0PGI, 2 0.0 0.02 0.0 0.0 0.0PGI, 3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.14

La distancia gentica de las poblaciones de raul tomando en cuanta los 23 alelos indicuna escasa diversidad gentica entre las poblaciones estudiadas. Esta distancia genticase utiliz para construir un dendrograma (Fig. 2 )

Fig 2 - Relaciones genticas de las poblaciones chilenas

Los resultados del dendrograma indican que dos (Vilches y Nahuelbuta) del macroclimacentro estn mas estrechamente relacionadas geneticamente, en comparacin con lapoblacin Santa Brbara (Fig. 2 ). Sin embargo, la poblacin Santa Brbara se encuentramas cercana genticamente a Melipeuco, poblacin perteneciente al macroclima sur(Fig.2 )

La estructura gentica de las procedencias en los dos macroclimas (Centro y Sur) indicaque la variabilidad gentica del raul chileno se encuentra principalmente entre laspoblaciones (70%). En este sentido, existe una menor diferenciacin gentica dentro delas poblaciones (26%) y solo una escasa diferenciacin (6%) entre el raul del centro y surdel pas, tomando en consideracin los loci analizados.

Vilches (C)

Nahuelbuta (C)

Neltume (S)

Melipeuco (S)

Santa Brbara (C)

Distancia gentica. Nei 1972

20

Introgresin

El estudio tendiente a detectar la presencia de introgresin en las poblaciones chilenas deraul indic que este fenmeno puede est presente, como haba sido descritoanteriormente con marcadores morfolgicos (Donoso et al, 1990). Para este estudio seutiliz el marcador gentico ADH, definido como potencial descriptor de hbridos entreambas especies. De las seis poblaciones analizadas, se detectaron alelos especficos deADH en dos poblaciones, lo que dio un 33% de introgresin. Las procedencias en que sedetect este fenmeno fueron Santa Brbara y Neltume, pertenecientes a los macroclimacentro y sur, respectivamente. Estos resultados podran indicar que no existe preferenciaentre los macroclimas por este flujo de genes. Si se analiza el porcentaje de introgresindentro de cada poblacin, se observa que el porcentaje fue de un 7,5%, igual en ambaspoblaciones. Este ltimo resultado podra confirmar la hiptesis anterior que estefenmeno es inespecfico en relacin a al macroclima. Es importante sealar tambin quelas poblaciones Neltume y Santa Barbara estn ubicadas en la VIII y X regin del pas.

COMPONENTE ARGENTINO

Al momento de iniciar la preparacin del proyecto la Unidad de Gentica Forestal delINTA EEA Bariloche ya se encontraba trabajando, conjuntamente con la Administracinde Parques Nacionales, en la recoleccin de semillas de Raul. Un proyecto conjuntoentre ambas instituciones financi la cosecha de 29 poblaciones de esta especie entre losaos 1994 a 1997. A su vez, con dicho proyecto, se hicieron estudios preliminares decontrol gentico de los marcadores isoenzimticos. Por otra parte, durante una estada dePaula Marchelli en Alemania (Intitut fr Forstgenetik, Grosshansdorf) en el ao 1997,financiada por el DAAD, se desarrollaron los marcadores de ADN de cloroplasto paraRaul. Una vez aprobado el proyecto, antes de hacerse efectivo, se comenz a trabajar enel anlisis poblacional con isoenzimas. Por esta razn, al iniciarse finalmente el proyecto,en el ao 2000, ya se contaba con la semilla, se haban determinado los marcadores autilizar y se haban analizado algunas poblaciones.

Metodologa

La metodologa utilizada en las diferentes etapas del Proyecto se halla descripta en formadetallada en las publicaciones cientficas, captulos en libros tcnicos y presentaciones aCongresos, resultado del presente estudio (Anexo 1 ).

1. Diversidad gentica

El estudio de las 20 poblaciones se realiz a travs de ocho marcadores gnicosisoenzimticos previamente determinados (Mdh-B, Mdh-C, Idh, Adh, Got-A, Got-B, Got-Cy Pgi-B) (Marchelli & Gallo, 2000). La ubicacin geogrfica de las poblaciones se muestraen el mapa de la figura 1 . Todas los sistemas enzimticos pertenecen al Grupo I(Bergmann, 1991) que est formado por enzimas constitutivas que participan en elmetabolismo primario. De los ocho loci estudiados, seis presentaron polimorfismo menor,mientras que slo dos se clasificaron como polimorfismo mayor o mayor extendido (Mdh-B y Got-A) en la mayora de las poblaciones.

El nmero medio de alelos por locus (AL) para la especie fue de 3,38 siendo la diversidadgnica () de 1,29 (Cuadro 1 ). Este valor fue variable entre las poblaciones, incluso entreaquellas pertenecientes a una misma cuenca lacustre, y en ninguna poblacin seencontraron todos los alelos (Fig. 2 ; Cuadro 2 ), siendo el promedio entre poblaciones de1,98. Este valor es ms alto que el nmero efectivo de alelos () que oscil entre 1,13 y

21

1,32, lo cual denota la presencia de polimorfismo menor con un alelo muy comn y otrosen baja frecuencia.

Algunos alelos (raros o no) fueron exclusivos de una o dos poblaciones. Es interesantedestacar que estas poblaciones que tienen alelos nicos se ubican geogrficamente enlos lmites sur y oeste. Por ejemplo, la poblacin del lmite sur (poblacin 1 de LagoEspejo) presenta un alelo exclusivo en el locus Got-C. Por otro lado, las poblaciones 14,19 y 26, todas situadas al oeste tambin presentan alelos nicos en distintos loci delsistema GOT.

Figura 1: Distribucin geogrfica de las poblaciones estudiadas de Raul enArgentina

Vn. Lann

S. Martn de los Andes

Lags. de Epulafquen

L. Espejo

L. Hermoso

L. Traful

L. Lolog

L. Quilln

L. Lacar

L. Huechulafquen

L. Tromen

L. orquinco

L. Curruhue

36 49

4040'

39 20'

71 21

40 00'

30 km

North

$5*(17,1$

&+,/(

22

Cuadro 1 - Diversidad gentica media en poblaciones argentinas de Raul

Locus Al Ho He PPP N

Mdh-B 5 1,97 0,45 0,52 1,00 4596Mdh-C 3 1,02 0,01 0,02 0,45 4850Idh 2 1,24 0,17 0,19 1,00 4572Adh 2 1,01 0,01 0,01 0,25 4672Got-A 3 1,78 0,39 0,46 1,00 4408Got-B 6 1,15 0,12 0,13 1,00 4430Got-C 4 1,15 0,12 0,13 1,00 4436Pgi 2 1,01 0,01 0,01 0,45 4896Media 3,38 1,29 0,16 0,18 4608Desvo 1,51 0,17 0,20

Al : nmero de alelos por locus, : diversidad gnica (nmero efectivo de alelos), Ho: proporcin deheterocigotas observados, He: heterocigosis esperada (Nei, 1973), PPP: proporcin de poblacionespolimrficas, n: nmero de alelos muestreados.

Figura 2 - Variacin entre poblaciones en la diversidad gnica (nmero efectivo de alelos,color lleno) y en el nmero medio de alelos (color rayado) del pool gnico. Cada color

representa a poblaciones de una misma cuenca

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

1 4 5 8 10 11 12 14 16 17 18 19 6 21 23 24 26 27 28 30

Poblacin

23

Cuadro 2 - Diversidad gentica en las poblaciones de Raul estudiadas

Pob. Locus

Mdh-B Mdh-C Idh Adh Got-A Got-B Got-C Pgi Pool gnico

Ho He Ho He Ho He Ho He Ho He Ho He Ho He Ho He P AL Ho He

1 1,94 0,49 0,49 1,00 0,00 0,00 1,12 0,10 0,11 1,00 0,00 0,00 1,91 0,43 0,48 1,12 0,10 0,11 1,19 0,16 0,16 1,01 0,01 0,01 75,0 1,88 1,20 0,16 0,17

4 2,04 0,61 0,51 1,01 0,01 0,01 1,06 0,06 0,06 1,00 0,00 0,00 1,54 0,18 0,35 1,01 0,01 0,01 1,01 0,01 0,01 1,00 0,00 0,00 75,0 1,88 1,13 0,11 0,12

5 2,10 0,56 0,52 1,00 0,00 0,00 1,69 0,45 0,41 1,00 0,00 0,00 1,81 0,52 0,45 1,06 0,06 0,06 1,05 0,05 0,04 1,00 0,00 0,00 62,5 1,75 1,23 0,20 0,19

6 1,79 0,40 0,44 1,00 0,00 0,00 1,13 0,10 0,12 1,00 0,00 0,00 1,96 0,35 0,49 1,08 0,08 0,08 1,08 0,08 0,08 1,00 0,00 0,00 62,5 1,75 1,18 0,13 0,15

8 1,97 0,37 0,49 1,02 0,02 0,02 1,05 0,05 0,05 1,00 0,00 0,00 1,66 0,40 0,40 1,08 0,08 0,08 1,08 0,08 0,08 1,01 0,01 0,01 87,5 1,88 1,16 0,13 0,14

10 1,85 0,47 0,46 1,07 0,04 0,07 1,08 0,06 0,08 1,05 0,04 0,05 1,89 0,46 0,47 1,12 0,11 0,10 1,12 0,11 0,10 1,06 0,04 0,06 100 2,38 1,21 0,17 0,17

11 1,91 0,47 0,48 1,03 0,03 0,03 1,19 0,14 0,16 1,04 0,03 0,04 1,61 0,36 0,38 1,05 0,05 0,05 1,05 0,05 0,05 1,06 0,03 0,06 100 2,25 1,18 0,14 0,16

12 1,88 0,32 0,47 1,00 0,00 0,00 1,34 0,19 0,25 1,00 0,00 0,00 1,76 0,37 0,43 1,20 0,18 0,17 1,20 0,18 0,17 1,00 0,00 0,00 62,5 1,75 1,23 0,16 0,19

14 2,02 0,40 0,50 1,01 0,01 0,01 1,05 0,05 0,04 1,01 0,01 0,01 1,83 0,48 0,45 1,81 0,45 0,45 1,86 0,44 0,46 1,01 0,01 0,01 100 2,75 1,32 0,23 0,24

16 2,00 0,44 0,50 1,06 0,06 0,06 1,13 0,12 0,11 1,00 0,00 0,00 1,92 0,51 0,48 1,19 0,14 0,16 1,20 0,15 0,17 1,00 0,00 0,00 75,0 1,75 1,23 0,18 0,19

17 2,09 0,59 0,52 1,00 0,00 0,00 1,03 0,03 0,03 1,04 0,04 0,04 1,35 0,25 0,26 1,10 0,10 0,09 1,10 0,09 0,09 1,00 0,00 0,00 75,0 1,88 1,15 0,14 0,13

18 1,97 0,43 0,49 1,00 0,00 0,00 1,19 0,15 0,16 1,00 0,00 0,00 1,74 0,32 0,43 1,09 0,09 0,08 1,06 0,06 0,06 1,02 0,00 0,00 62,5 1,75 1,18 0,13 0,15

19 2,01 0,52 0,50 1,02 0,00 0,02 1,59 0,38 0,37 1,01 0,01 0,01 1,54 0,36 0,35 1,22 0,20 0,18 1,21 0,19 0,18 1,01 0,01 0,01 100 2,38 1,25 0,21 0,20

21 1,94 0,31 0,48 1,00 0,00 0,00 1,14 0,14 0,13 1,00 0,00 0,00 1,87 0,41 0,47 1,27 0,22 0,21 1,26 0,21 0,20 1,01 0,01 0,01 75,0 1,88 1,23 0,16 0,19

23 1,58 0,28 0,37 1,00 0,00 0,00 1,12 0,11 0,11 1,00 0,00 0,00 1,90 0,34 0,47 1,15 0,14 0,13 1,15 0,14 0,13 1,00 0,00 0,00 62,5 1,75 1,16 0,13 0,15

24 2,02 0,53 0,50 1,02 0,02 0,02 1,30 0,24 0,23 1,00 0,00 0,00 1,95 0,48 0,49 1,09 0,09 0,09 1,09 0,08 0,08 1,00 0,00 0,00 75,0 2,13 1,21 0,18 0,18

26 1,95 0,47 0,49 1,06 0,06 0,06 1,20 0,10 0,17 1,00 0,00 0,00 1,55 0,32 0,35 1,09 0,06 0,08 1,06 0,04 0,05 1,00 0,00 0,00 75,0 2,25 1,18 0,13 0,15

27 2,17 0,46 0,54 1,02 0,02 0,02 1,53 0,31 0,35 1,00 0,00 0,00 1,97 0,40 0,49 1,06 0,05 0,05 1,06 0,05 0,05 1,02 0,02 0,02 87,5 2,13 1,23 0,16 0,19

28 2,11 0,41 0,53 1,00 0,00 0,00 1,52 0,29 0,34 1,00 0,00 0,00 1,85 0,36 0,46 1,06 0,06 0,06 1,07 0,07 0,06 1,00 0,00 0,00 62,5 1,75 1,22 0,15 0,18

30 2,14 0,52 0,53 1,00 0,00 0,00 1,39 0,28 0,28 1,00 0,00 0,00 1,98 0,38 0,50 1,17 0,14 0,14 1,17 0,14 0,14 1,01 0,01 0,01 75,0 1,88 1,25 0,18 0,20

24

La heterocigosis media observada fue de 15,9 %, aunque este valor fue muy variableentre los distintos loci analizados, siendo los ms polimrficos Mdh-B y Got-A (Tabla1.1.1). La heterocigosis para el pool gnico fue muy variable no slo entre poblacionessino tambin dentro de las cuencas (Fig. 3 ; Cuadro 2 ), alcanzando valores de hasta 23%.

Figura 3 - Variacin entre poblaciones en la heterocigosis observada ( Ho, colorlleno) y esperada ( He; Nei, 1973, color rayado). Cada color representa a poblaciones

de una misma cuenca.

2. Diferenciacin

Tanto las frecuencias allicas como las genotpicas fueron significativamente distintasentre las poblaciones para todos los loci analizados ( = 0,05).

La mayor distancia gentica para el pool gnico se encontr entre las poblaciones 5 y 14(d0 = 0,152) y la menor entre las 27 y 28 (d0 = 0,017) (ambas de la cuenca del LagoTromen). La mayora de las distancias fueron significativamente diferentes. El anlisis decluster del pool gnico separa por completo la poblacin 14 (cuenca del Lago Lcar) yagrupa, separado del resto, a las poblaciones 19 y 30 (Fig. 4 ). Los grupos que se formanno tienen relacin con la ubicacin de las poblaciones en las cuencas lacustres.

El test de Mantel tampoco denot una asociacin entre las distancias genticas y lasgeogrficas. Las distancias genticas entre las poblaciones dentro de una misma cuencalacustre resultaron significativamente diferentes.

Los valores de diferenciacin entre cada poblacin y su complemento (Dj) para el poolgnico variaron entre 2,4 y 8,1 %, siendo las poblaciones 5, 14, 19 y 30 las msdiferenciadas. El nivel medio de diferenciacin gnica (ge) para el pool de loci analizadosfue de 4,7 % (FST = 5,2 %) (Fig. 3 ).

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

1 4 5 8 10 11 12 14 16 17 18 19 6 21 23 24 26 27 28 30

Poblacin

25

Figura 4 - Dendrograma obtenido con el mtodo UPGMA utilizando las distancias deGregorius para el pool de loci analizados.

3. Anlisis entre cuencas y variacin geogrfica

Como primer paso se prob la homogeneidad de las frecuencias allicas entrepoblaciones dentro de cada cuenca, resultando en todos los casos diferenciassignificativas en las frecuencias allicas en al menos tres de los ocho loci. Comparacionesde todos los pares de poblaciones posibles dentro de cada cuenca tambin revelarondiferencias significativas tanto en las frecuencias allicas como en las distanciasgenticas para el pool gnico.

Por otro lado, se calcularon los valores de diferenciacin entre poblaciones dentro decada cuenca lacustre, los cuales tambin fueron muy elevados, indicando laheterogeneidad de las poblaciones (Cuadro 3 ). En algunos casos el nivel dediferenciacin fue mayor que entre las 20 poblaciones, por lo que una comparacin entrecuencas agrupando las poblaciones de cada una en un conjunto es totalmente invlido.

Si bien la variacin dentro de las cuencas es muy grande, se evalu la posibilidad de unavariacin latitudinal en las frecuencias allicas y las medidas de diversidad gentica. Losresultados mostraron una asociacin significativa (P < 0,03) nicamente en la diversidadgentica del locus Idh, la cual disminuye con la latitud (r = -0,47).

26

Figura 5 - Caracol de diferenciacin , segn Gregorius & Roberds (1986) para el poolgnico y los ocho loci analizados. Cada seccin corresponde a una poblacin y cada color

a poblaciones de una misma cuenca lacustre. El radio de cada seccin representa ladiferenciacin de dicha poblacin con respecto a su complemento (Dj) y el ngulo

representa el tamao proporcional de cada poblacin (cj). El crculo en lnea punteadacorresponde al nivel de diferenciacin media entre poblaciones ().

Cuadro 3 - Diferenciacin entre poblaciones dentro de las distintas cuencas paracada locus y el pool gnico.

Cuenca

Mdh-B Mdh-C Idh Adh Got-A Got-B Got-C Pgi Pool

Hermoso (2) 2,8 0,4 25,4 0,0 43,5 2,6 1,8 0,0 9,6

Lcar (6) 9,1 1,8 4,2 1,2 5,6 8,2 8,4 1,5 5,0

Lolog (3) 18,4 0,5 13,1 1,3 7,8 3,9 4,0 0,3 6,2

Huechulafquen (5) 12,9 1,2 3,2 0,0 7,2 3,4 3,1 0,2 3,9

Tromen Quilln (3) 16,3 0,5 3,6 0,0 5,9 3,3 3,2 0,4 4,2

Entre parntesis se indica el nmero de poblaciones.

14

5

19

30

17

26

11

27

4

23 6 10

16

12

18

8

21

28

1 24

Pool gnico=0,047

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

27

DIVERSIDAD Y DIFERENCIACIN GENTICA DETECTADA CON MARCADORESISOENZIMTICOS EN ROBLE

INTRODUCCIN

En Chile la distribucin del roble (Nothofagus obliqua) est dividida en Regiones deProcedencia, conformadas por reas o conjunto de reas con condiciones ecolgicasuniformes. Esta clasificacin est basada principalmente en factores climticos con apoyode mapas de vegetacin y de tipos forestales, que abarcan la Cordillera de la Costa, ValleLongitudinal y Cordillera de los Andes (Vergara et al. 1998).

El conocimiento de la diversidad gentica de una especie es una pieza clave paracualquier iniciativa de mejoramiento o conservacin gentica. El roble cuentan con unagran variabilidad morfolgica dentro y entre sus distintas poblaciones. Esta situacin, hasido confirmada por algunos estudios genecolgicos, dentro de los que se destacan lostrabajos de Donoso (1979a y 1979b). Recientemente, Ipinza et al. (2.000), concluyeronque los rasgos morfolgicos de la semilla, germinacin y crecimiento inicial tiene un altocontrol gentico y adems que algunas de estas caractersticas presentan uncomportamiento clinal y otras ecotpicas, a lo largo de su distribucin geogrfica.

La importancia de conocer la estructura de la variacin gentica de una especie,diferenciando poblaciones en su rea de distribucin, radica en que dicha informacin esvital al momento de decidir qu material gentico utilizar en un programa de plantacionespara una regin determinada o establecer una estrategia de conservacin y mejoramientogentico a largo plazo (Zobel y Talbert 1984, Delmastro 1997). Por otro lado, la utilizacinde un carcter como marcador gnico requiere el establecimiento de la relacin unvocaentre el fenotipo y cada uno de los genes involucrados en su expresin. Esto se logra atravs del anlisis de control gentico, que determina el modo de herencia (modo detransmisin y modo de accin gnica) de los fenotipos enzimticos.

Las isoenzimas han demostrado ser una tcnica adecuada para describir la variacingentica en Nothofagus (Pineda, 2000). Las principales ventajas de esta tecnologa sepueden resumir en su simpleza y bajo costo. Sin embargo, el nmero de loci posible dedetectar constituye una desventaja en relacin al uso de los marcadores moleculares.

Los objetivos de este trabajo fueron: 1) Determinar la herencia y patrones de variossistemas isoenzimticos; y 2) usar esta informacin para determinar la estructura genticade esta especie.

COMPONENTE CHILENO

Materiales y mtodos

En Chile se analizaron 10 procedencias de roble representativas de las macroregionescentro y sur del pas (Cuadro 1 ) ya que en las dos colectas realizadas no fue posiblecolectar semillas viable de la procedencia (1C), nica procedencia que representa la zonacentro-norte.

Las semillas colectadas en los tres poblaciones (Til Til, Lampa y Alhue) que componen laprocedencia (1C) presentaron prcticamente un 100% de semillas vanas y daadas porinsectos, lo que hizo impsible obtener material para los anlisis.

28

Cuadro 1 - Macroclima, procedencia y poblaciones de roble utilizadas en el anlisisisoenzimtico del roble en Chile

Macroclima Procedencia PoblacinCentro 2 C Quirihue

3 C Lago Lanalhue6 D Quepe8 A Vilches9 A Recinto

Sur 4 C Cuesta Lastarria5 C Llancacura7 D Malalhue11 A Cunco13 A Choshuenco

Los sistemas isoenzimticos analizados fueron ADH, IDH, PGI, GOT, SKDH. Estossistemas fueron seleccionados debido a su buena resolucin y consistencia en lostrabajos realizados por el INTA. Adems, para homologar los resultados de roble chileno yargentino, un profesional chileno viaj al Laboratorio del INTA, Bariloche a realizar estosanlisis. El tamao de la muestra fue de 40 rboles por poblacin.

29

Fig. 1 - Ubicacin geogrfica de las poblaciones de roble analizadas

30

Anlisis estadstico

Los datos de isoenzimas fueron usados para estimar varios estadgrafos de variacingentica como: nmero de alelos por locus, porcentaje de diversidad gnica, porcentajede heterocigocidad, coeficiente de polimorfismo (PIC), y el coeficiente de consanguinidad.Estos estadgrafos fueron calculados por locus y como promedio poblacional. Adems deestos valores se calcularon las frecuencia allica, varianza y la desviacin estndar porlocus y las frecuencias allicas por poblacin. Con estas frecuencias allicas se puedendistinguir los alelos que se encuentra en una alta frecuencia como aquellos alelos conbaja frecuencia, considerados raros o con escasa presencia a nivel poblacional.

Para determinar la similitud entre las procedencias estudiadas se calcul la distanciagentica de acuerdo entre pares de procedencias utilizando la distancia gentica de Nei(1973). Estos valores fueron usados posteriormente para confeccionar un dendrograma,utilizando el mtodo de UPGMA para ilustrar las relaciones genticas entre laspoblaciones estudiadas. Para estudiar la estructura gentica de las procedenciasevaluadas se realiz un anlisis de varianza para determinar sus componentes. De estamanera se pudo apreciar los porcentajes de variacin entre y dentro de las poblaciones.

Resultados

El anlisis de los datos isoenzimticos indic que los sistemas ADH, IDH, PGI y GOTpresentaron una buena resolucin, sin embargo, el sistema SKDH present problemas deresolucin y consistencia en las muestras en las poblaciones analizadas por lo que seresolvi eliminarla del anlisis.

En los sistemas que presentaron una buena resolucin, ADH, IDH y PGI presentaron unasola zona de tincin en comparacin con el GOT que present tres zonas, denominadasGOT-A, GOT-B y GOT-C (Cuadro 2 ).

Cuadro 2 - N de alelos, diversidad gnica, hetocigocidad, PIC, Coeficiente deconsanguinidad de poblaciones de roble.

Loci N alelos Diversidad Heterocigocidad PIC Cof. Consanguinidadgnica

ADH 2 0.13 0.15 0.13 -0.08IDH 4 0.28 0.23 0.26 0.15PGI 3 0.26 0.28 0.24 -0.07GOT-A 2 0.01 0.01 0.01 0.00GOT-B 4 0.23 0.23 0.21 0.02GOT-C 1 0.00 0.00 0.00 .Promedio 2.67 0.15 0.15 0.14 0.02

En total las isoenzimas utilizadas permitieron detectar 16 alelos y el nmero promedio dealelos fue 2,7. El sistema que detect un mayor nmero de alelos fue el GOT si seconsidera como sistema isoenzimatico ya que con sus tres zonas de tincin detect 7alelos. Dentro de este sistema GOT-B detect 4 alelos, GOT-A 2 alelos y GOT-C 1 alelo.IDH, PGI y ADH detectaron 4, 3 y 2 alelos, respectivamente (Cuadro 2 ).

El promedio de diversidad gentica obtenido fue de 0.17, sin embargo se observarondiferencias entre los sistemas isoenzimticos evaluados. Por ejemplo, PGI detect unadiversidad gentica de 0.30, muy similar a GOT-C con un 0.29 comparado con ADH que

31

dio un valor de 0.11. GOT-C no detect diferencias entre el material analizado, debido asu monomorfismo (Cuadro 2 ).

El nivel de heterocigosidad, sigui un patrn similar a diversidad gentico, lo cual se vioreflejado en su valor promedio (0.17). Sin embargo, el valor de heterocigosidad fuediferente en algunos casos, por ejemplo, el sistema PGI present un valor superior al dela diversidad gentica (0.35 vs 0.30) pero en el caso de IDH y GOT-B se presentaronvalores inferior de heterocigosidad que de diversidad gentica (Cuadro 2 ).

El PIC (Polimorphic index coefficient), present un valor de 0.16, con un mayor valor en elsistema PGI e IDH (0.27), similar a GOT-B (0.26), seguido de ADH (0.11) y GOT-A (0.02)(Cuadro 2 ).

El coeficiente de consanguinidad promedio fue cero, sin embargo, se observ un valorpositivo de 0.15 con el sistema IDH. El resto de los valores fueron muy bajos y algunosnegativos (Cuadro 2 ).

Las frecuencias allicas de los 16 loci en las 5 poblaciones de roble indic una diferentefrecuencia, salvo en el caso de GOT-C que fue monomorfico. En esta situacin, todos losrboles de las poblaciones analizadas presentaron el mismo alelo (Cuadro 3 ). En lossistemas polimrficos, los alelos con mayor frecuencia fueron: Alelo 1, GOT-A (0.99), alelo1, ADH (0.94); alelo 3, IDH (0.84), alelo 2, GOT-B (0.83) y Alelo 3, PGI (0.82). Por otrolado, los alelos raros o con menor frecuencia fueron: alelo2 y 4 de GOT-B con un 1%(Cuadro 3). La desviacin estndar de las frecuencias allicas fue bastante baja y fluctuentre un 1 y 2%, en los alelos polimrficos (Cuadro 3 ).

Cuadro 3 - Frecuencias allicas de 16 loci en 10 poblaciones de roble chileno

Loci N alelos Frecuencia Desviacin estndar

ADH 1 0.93 0.01

ADH 2 0.07 0.01

IDH 1 0.06 0.01

IDH 2 0.84 0.02

IDH 3 0.08 0.02

IDH 4 0.01 0.01

PGI 1 0.03 0.01

PGI 2 0.12 0.01

PGI 3 0.85 0.02

GOT-A 1 0.99 0.00

GOT-A 2 0.01 0.00

GOT-B 1 0.11 0.01

GOT-B 2 0.87 0.02

GOT-B 3 0.02 0.01

GOT-B 4 0.01 0.00

GOT-C 1 1.00 0.00

Las frecuencias allicas por poblacin indic que los alelos con mayor frecuencia en lapoblacin estuvieron representados en todas las poblaciones analizadas (Cuadro 4 ). Porejemplo, el alelo 2 de ADH tuvo una frecuencia superior al 90% en las cuatro poblacionesanalizadas. Por otro lado, los alelos raros o de menor frecuencia como el alelo 4 de GOT-

32

B se present con un 1% en la procedencias A11 y no se present en las procedenciasA13, A9 y C14.

Cuadro 4. Frecuencias allicas de 16 loci en 10 poblaciones chilenas de roble

Macroclima Centro Macroclima Sur

Loci Allele C2 C3 A8 A9 D6 C4 C5 D7 A11 A13

ADH 1 0.94 1.00 0.74 0.94 0.88 0.97 0.97 1.00 0.91 1.00

ADH 2 0.06 0.00 0.26 0.06 0.13 0.03 0.03 0.00 0.09 0.00

GOT-A 1 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.96 1.00

GOT-A 2 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.04 0.00

GOT-B 1 0.00 0.16 0.03 0.19 0.06 0.15 0.15 0.00 0.06 0.08

GOT-B 2 1.00 0.84 0.97 0.81 0.94 0.80 0.85 1.00 0.86 0.92

GOT-B 3 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.03 0.00 0.00 0.06 0.00

GOT-B 4 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.03 0.00 0.00 0.01 0.00

GOT-C 2 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

IDH 2 0.09 0.00 0.06 0.10 0.00 0.00 0.03 0.00 0.11 0.04

IDH 3 0.85 0.75 0.75 0.85 1.00 1.00 0.78 1.00 0.78 0.96

IDH 4 0.06 0.25 0.19 0.04 0.00 0.00 0.19 0.00 0.08 0.00

IDH 5 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.04 0.00

PGI 1 0.00 0.03 0.11 0.01 0.00 0.01 0.00 0.00 0.08 0.00

PGI 2 0.08 0.13 0.18 0.13 0.03 0.18 0.08 0.00 0.16 0.07

PGI 3 0.92 0.84 0.71 0.86 0.98 0.81 0.93 1.00 0.76 0.93

La distancia gentica de las cuatro poblaciones, basada en los 16 alelos detectados indicuna escasa diversidad gentica entre las poblaciones estudiadas. Estas distanciasgenticas fueron utilizadas para construir un dendrograma (Fig. 2 )

33

Fig. 2. Dendrograma de poblaciones de roble chileno

Las distancias genticas indican solo una leve relacin geogrfica entre las poblacionescolectadas en el macroclima centro y sur (Fig. 2 ). Por ejemplo, se observa una buenaasociacin entre Vilches, Quirihue y Quepe, pertenecientes al macroclima centro yLancacura y Cunco (macroclima sur).

La estructura gentica de las procedencias de roble estudiadas que la diversidad genticaexistente en las poblaciones estuvo radicada principalmente dentro y entre laspoblaciones, con un 45 y 50%, respectivamente.

Introgresin

El estudio de deteccin de hbridos en poblaciones de roble indic que de las 10procedencias evaluadas, siete presentaron hbridos, lo que equivale a un 70%. El procesode deteccin de los hbridos se realiz con el marcador gentico ADH. En estaoportunidad se detectaron hbridos en cuatro poblaciones en el macroclima centro y trespoblaciones en el macroclima sur, similar tendencia a la observada en raul, donde no sepresent una preferencia del este fenmeno por macroclima. El anlisis de cadapoblacin fue variable, observndose los mayores porcentajes en la poblacin Vilches conun 50% (macroclima centro) y Melipeuco con un 35% (macroclima sur).

Vilches

Quirihue

Quepe

Choshuenco

Malalcahuello

L. Lanalhue

Llancacura

Cunco

Recinto

CuestaLastarria

34

COMPONENTE ARGENTINO

2. Roble

Metodologa

La metodologa utilizada en las diferentes etapas del Proyecto se halla descripta en formadetallada en las publicaciones cientficas, captulos en libros tcnicos y presentaciones aCongresos, resultado del presente estudio (Anexo 1 ).

2.1 - Diversidad gentica

A travs del anlisis isoenzimtico realizado en las 14 poblaciones del rea de distribucinnatural de Nothofagus obliqua en Argentina (Figura 2.1.1 ) con los 7 marcadores gnicosidentificados en el anlisis de control gentico (Skdh, Idh-B, Adh, Pgm-A, Pgi-B, Got-B yGot-C) se realiz la caracterizacin gentica de las mismas (Cuadro 2.1.1 ).

Cuadro 2.1.1 - Parmetros de diversidad gentica poblacional

Cuenca Poblacin NA P AP Ho He

1. Bandurrias 12 71 1,71 0.123 0.132 1.1522. Yuco 14 71 2,00 0.180 0.191 1.2363. Nonthu 14 85 2,00 0.138 0.180 1.2204. Hua Hum 14 85 2,00 0.164 0.175 1.2115. Po Protto 16 85 2,28 0.134 0.189 1.233

Lcar

14. Quila Quina 16 100 2,28 0.219 0.264 1.3596. Seccional 19 100 2,71 0.182 0.243 1.3217. Corral de Bueyes 16 85 2,28 0.170 0.203 1.255Quilln8. Cabecera Oeste 15 85 2,14 0.221 0.240 1.3179. Pulmar 15 85 2,14 0.139 0.229 1.29810. Seccional 17 100 2,42 0.204 0.297 1.422orquinco11. Chumpiru 14 85 2,00 0.185 0.240 1.315

Pilolil 12. Pilolil 13 71 1,85 0.242 0.256 1.344Epulaufquen 13. Epulaufquen 16 85 2,28 0.239 0.278 1.386

P= porcentaje de loci polimrficos AP= nmero medio de alelos por locus polimrficoHe= heterocigosis esperada Ho= heterocigosis observada = diversidad

35

Figura 2.1.1 - Distribucin geogrfica de las poblaciones estudiadas de Roble enArgentina

La diversidad gentica intrapoblacional present un patrn dentro de la cuenca, donde losvalores mayores correspondan a las poblaciones de localizacin este. Asimismo, laspoblaciones marginales Pilolil y Epulafquen, de localizacin este y norte respectivamentede la distribucin, mostraron valores de diversidad elevados respecto al resto de laspoblaciones.

Dos nicos alelos exclusivos: alelo 3 para Got-B y alelo 3 para Got-C fueron encontradosen la poblacin ubicada en la cabecera este del Lago Quilln. La presencia del alelo 2especie-especfico de Nothofagus nervosa (Gallo et al., 1997; Marchelli y Gallo, 1999),diagnstico para la deteccin de hbridos interespecficos N. obliqua x N. nervosa, mostrun patrn longitudinal en su frecuencia, con valores mayores en las poblaciones delocalizacin oeste, tanto en la cuenca del lago Quilln, como en orquinco, a pesar de lano presencia de poblaciones de N. nervosa en esta ltima. La poblacin ubicada ms alnorte y este de la distribucin (Epulafquen) present los mayores valores de frecuenciadel alelo 2 para Adh, en un rea en la que N. nervosa no vegeta (Figuras 2.1.2 y 2.1.3).

Figura 2.1.2 - Frecuencia del alelo 2 ADH Figura 2.1.3 - Frecuencia del alelo 2 ADHvs.longitud vs. latitud

2.2 - Diferenciacin

La diferenciacin gentica entre poblaciones, medida a travs de la distancia gentica deGregorius (Gregorius, 1974) aplicada a un anlisis de clusters a travs del MtodoUPGMA (valor cofentico r=0.7604) mostr un dendrograma con clusters poco definidos ycon falta de un agrupamiento notorio entre poblaciones pertenecientes a la misma cuenca(Figura 2.2.1 ).

ADH: Frecuencia alelo 2 con incremento en longitud

12

13

96 5

1011

7

1

8

14

2 3

4

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Incremento en longitud

Fr alelo 2

ADH Frecuencia alelo 2 conincremento en latitude

13

1110

96

7

8

12

5 31

24

14

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Fr alelo 2

Incremento en latitud

36

Figura 2.2.1 - Dendrograma poblaciones basado en la distancia de Gregorius

Figura 2.2.2 - Caracol de Gregorius. Diferenciacin entre poblaciones DjObs.: las poblaciones pertenecientes a una misma cuenca se presentan en un mismo color.

Caracol de diferenciacin(Gregorius and Roberds, 1986)

Pool gnico

0

0,1

0,051

9

10

13

7

4512

14

2

11

8

36

37

El test de Mantel para la correlacin entre matrices de distancia gentica y distanciageogrfica confirm el resultado hallado en el dendrograma, con un r= 0.021. Ladiferenciacin del pool gnico entre poblaciones, evaluada a travs del parmetro Dj(Figura 2.2.2 ) mostr a las poblaciones orquinco 9 y orquinco 10 como las msdiferenciadas respecto al complemento.

2.3 - Anlisis entre cuencas y variacin geogrfica

El anlisis de clusters tomando a las cuencas como OTUs mostr un dendrograma dondeorquinco y Quilln constituyen un cluster con Lcar, mientras que Pilolil y Epulafquenaparecen a una mayor distancia (Figura 2.3.1 ). Estas dos ltimas cuencas conformanregiones marginales dentro del rea de distribucin de la especie, localizadas al este ynorte, respectivamente.

Figura 2.3.1 - Dendrograma cuencas Nothofagus obliqua .Referencias: L (Cuenca Lcar), Q (Cuenca Quilln), (Cuenca orquinco), P (Cuenca Alumin), E

(Cuenca Epulafquen)

Cuencas Nothofagus obliqua

Dendrograma

Distancia de Gregorius0.020 0.034 0.048 0.061 0.075

L

L

Q

P

E

38

CARACTERIZACIN GENTICA DE NOTHOFAGUS OBLIQUA Y N. ALPINAMEDIANTE RAPD

INTRODUCCION

El roble y el raul pertenecen al gnero Nothofagus y corresponden a las especies N.obliqua y N.alpina, respectivamente.

En Chile, estas especies estn presentes en una superficie de 1.672.475 has., con unaamplia distribucin geogrfica que se extiende desde V hasta la X regin, tanto en laCordillera de la Costa como en los Andes y desde los 500 m (raul) hasta los 2.000 m(roble) de altura. Esta amplia distribucin geogrfica a lo largo de Chile, podra ser elresultado de una alta variabilidad gentica en ambas especies, lo cual les permiteadaptarse a diferentes condiciones edafoclimticas.

El conocimiento de la variabilidad gentica de una especie es un requisito indispensablepara fijar estrategias de conservacin, mejoramiento gentico y su utilizacin racional.Tradicionalmente, la descripcin de la variabilidad se ha basado en la descripcinfenotpica (morfologa, crecimiento y caracterstica productivas) del germoplasma.Actualmente, a este tipo de descripcin se han incorporado otras metodologas como sonlos marcadores moleculares para caracterizar las especies a nivel de genotipo. El anlisisde los marcadores moleculares es considerada una herramienta potencialmentepoderosa en la caracterizacin y descripcin de la estructura gentica del germoplasma.

Desde hace varias dcadas, a travs de la biologa molecular se han desarrollado variastcnicas para detectar y cuantificar la variabilidad gentica (polimorfismo) a nivel de ADN.En una primera etapa, uno de los marcadores moleculares mas usados en diversasespecies fueron los RFLPs (Tanksley y otros, 1989), pero actualmente es considerado unprocedimiento lento y de alto costo. Posteriormente, Welsh y McClelland (1990) yWilliams y otros (1990) describieron la Amplificacin al azar del ADN polimrfico (RAPD),una tcnica basada en la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR).

Esta tcnica usa partidores de 10 mers, para amplificar al azar secuencias del ADNgenmico en estudio. La amplificacin del ADN, ocurre a travs de ciclos trmicossecuenciales que permiten denaturar, complementar el partidor a la cadena molde yposteriormente sintetizar una nueva cadena de ADN (Williams y otros, 1990). Losdiferentes patrones y bandas amplificadas permiten cuantificar diferencias genticas entrey dentro de las especies.

Entre las ventajas del uso de RAPDs, estn su herencia Mendeliana, preferentementedominante, la facilidad de aplicacin y su alta eficiencia en detectar polimorfismo. Estahabilidad de detectar regiones de ADN altamente variables tiene una tremendapotencialidad en identificacin de razas, estudios de hibridacin inter e intraespecfica, enel estudio de la variacin gentica de poblaciones y en el mapeo de genes.Adicionalmente, estn la rapidez en la obtencin de resultados, costo, el no uso deradioactividad y una cantidad reducida de ADN.

Los objetivos de este trabajo son: a) determinar la diversidad gentica del germoplasma deroble y raul, usando marcadores moleculares (RAPD); b) establecer posibles relacionesentre la diversidad gentica y su distribucin geogrfica; y c) detectar posibles hbridos entreestas dos especies.

39

El objetivo general de este estudio fue evaluar la variabilidad gentica de poblaciones deroble y raul mediante marcadores genticos, para ayudar a la conservacin, el mejoramientogentico y el manejo silvcola en ambas especies. Ello a travs de los siguientes objetivosespecficos: a) Identificar y relacionar genticamente procedencias de raul y roble, mediantemarcadores moleculares (RAPD); b) asociar la informacin gentica-molecular con ladistribucin geogrfica; y c) detectar introgresin entre poblaciones naturales de estasespecies.

MATERIALES Y MTODOS

Para el estudio de diversidad gentica mediante RAPD, se analizaron 10 individuos dentro decada poblacin chilena y argentina (Cuadro 1 ). La extraccin de ADN se realiz desde hojasjvenes y liofilizadas, tanto para el estudio de diversidad gentica, como para el deintrogresin (Cuadros 1 y 2 ). Durante la extraccin de ADN, las hojas fueron maceradas enun mortero en presencia de nitrgeno lquido. Al material macerado se le agreg 300 l detampn de extraccin (50 mM Tris pH 8,0; 0,7 M NaCl; 10mM EDTA; 2%CTAB y -mercaptoetanol) y se incub durante 45 min. a 65C.

Posteriormente, las muestras fueron enfriadas y se realizaron dos extracciones proteicas concloroformo-alcohol isoamlico (24:1). La emulsin fue centrifugada a 4.500 rpm por 15 minutos,para la separacin de las fases. El sobrenadante acuoso se transfiri a un tubo limpio, y seprecipit el ADN con Isopropanol. El precipitado fue lavado con etanol (76%; 10 mM NH4Ac) ysecado a temperatura ambiente. Finalmente, el ADN fue resuspendido (TE pH 8.0) y tratado conARNasa y se midi su concentracin en un fluormetro (DyNA QuantTM, Hoefer).

Anlisis molecular mediante RAPD

1. Screening de partidores . Se realiz un pre-screening con 40 partidores de RAPD de 10mers (Operon Technologies, Alameda, California, CA), para seleccionar aquellos quepresentaran el mayor nivel de polimorfismo y reproducibilidad.

2. Estudio de diversidad gentica : Se seleccionaron 20 partidores de las Series OPAB yOPAD, para realizar el anlisis de 340 individuos de roble y 110 de raul. Para determinarintrogresin se analizaron 22 partidores de RAPD.

3. Ajustes de las condiciones de reaccin y amplificacin. La reaccin de amplificacindel ADN se realiz primeramente en un volumen total de 25l conteniendo: 10x buffer, 0,3mM de MgCl2, 0,2 mM de cada nucletido, 0,2 M de partidor, 1 unidad de Taqpolimerasa. Durante este proceso se evaluaron tres concentraciones de ADN (5, 10 y 25g) y dos condiciones de reaccin y amplificacin.

4. Anlisis de las condiciones de amplificacin . Fueron: a) 3 ciclos de 95C por 1 min.;37C por 1 min.; 72C por 1 min. 20 s; luego 37 ciclos de 94C por 37 s; 40C por 40;72C por 1 min. 20 s. y b) 35 ciclos de 92 por 15 s; 34 por 1 min.; 72 por 2 min.

40

Cuadro 1 - Material vegetal utilizado para los estudios de diversidad gentica enroble y raul, mediante RAPD

Pas Macroclima Regin Punto Reg. Prov. Comuna LugarEspecie: Nothofagus obliqua (roble)

R. N. Los Ruiles VII Cauquenes Cauquenes Los RuilesCentro 2-CQuirihue VIII uble Quirihue QuirihueCayumanqui VIII Concepcin Quilln Cerro CayumanquiCuranilahue VIII Arauco Curanilahue San Jos de ColicoL. Lanalhue VIII Arauco Caete Cam. Caete-Purn

Centro 3-C

Pichipillahun IX Malleco Galvarino PichipillahunCuesta Lastarria IX Cautn Loncoche San AntonioSur 4-CCruces X Valdivia Valdivia Sector CayumapuLlancacura X Valdivia La Unin TrumaoSur 5-CPurranque X Osorno Purranque Cam.Purranque-FrutillarVictoria IX Malleco Victoria Inspector FernndezSur 6-DQuepe IX Cautn Freire QuepeMalalcahuello X Valdivia Lanco PurulnFutrono X Valdivia Futrono Futrono

Sur 7-D

Rupanco X Osorno P. Octay Hacienda RupancoVilches VII Talca San Clemente VilchesCentro 8-ABullileo VII Linares Parral BullileoR. Nac. uble VIII uble Recinto Las TrancasRalco VIII Bio-Bio Santa Brbara Camino Ralco-PangueRecinto VIII uble Pinto Cam.Pinto-Recinto km.10

Centro 9-A

Sta. Brbara VIII Bio-Bio Santa Brbara Parcela 43L. Galletue IX Malleco Melipeuco IcalmaCunco IX Cautn Cunco LomacuraL. Colico IX Cautn Cunco Puerto PumaMelipeuco IX Cautn Melipeuco El Manzano

Sur 11-A

Curarrehue IX Cautn Curarrehue PuescoChoshuenco X Valdivia Panguipulli Puerto Fuy

CHILE

Sur 13-ALlifn X Valdivia Futrono LlifnHua humLas Lagunas deEpulaufquenQuillnQuilln 2Quila Quina

ARGENTINA Sur 13-A

PilolnEspecie: Nothofagus alpina (raul)

Centro 3-C Pichipillahun IX Malleco Galvarino Pichipillahun

Las trancas X Valdivia La Unin Cam. Trumao-HueicollaSur 5-CHuellusca X Osorno Purranque Huellusca

Radal 7 Tazas VII Curic Molina RadalCentro 8-A

Emb. Bulileo VII Linares Parral Bullileo

Recinto VIII uble Pinto Los Lleuques Atacalco

Sta. Brbara VIII Bio-Bio Santa Brbara El huachi

Centro 9

Jauja IX Malleco Collipulli Jauja

Malalcahuello IX Malleco Curacautn MalalcahuelloSur 11- A

Curarrehue IX Cautn Curarrehue Puesco

CHILE

Sur 13-A Releco X Valdivia Panguipulli Releco

41

Cuadro 2 - Material vegetal utilizado para los estudios de introgresin gentica enroble y raul, mediante RAPD

Macroclima PoblacinCentro Quepe 427-I 427-IV 427-V Quepe 428-I 428-III 428-VSur Cunco 424-I 424-II 424-IV L. Colico 438-I 438-II 438-III 438-IV Cuesta Lastarria 449-I 449-II Curarrehue 458-II 458-III 458-V Llifn 505-II 505-IV Llancacura 517-III 517-IV

525-I 525-II 525-III 525-IV Rupanco 537-I 537-IV Purranque 550-I 550-II 550-V

Ambas condiciones de amplificacin terminan con un perodo de extensin de 72C por 10 min. yde refrigeracin a 4 hasta realizar la electroforesis.

El criterio de seleccin de la concentracin de ADN y condiciones de amplificacin a usaren el estudio fueron la nitidez y reproducibilidad de los productos amplificados. Para esteanlisis se utiliz un termocliclador de 96 muestras con tapa calefactora.

Electroforesis

Un total de 12 l del producto de la amplificacin se carg en geles de agarosa (1,5%; 1XTAE). La electroforesis se realiz a un voltaje constante de 120 volts. En cada gel seincluy un marcador estndar (Ladder de 123 bp) para determinar el tamao de losfragmentos obtenidos. Posterior a la electroforesis, los geles fueron teidos con bromurode etidio y fotografiados bajo luz ultravioleta para su posterior evaluacin.

RESULTADOS

Diversidad Gentica

De los 40 partidores iniciales, se seleccionaron 20 para realizar el anlisis de diversidadgentica, basados en la reproducibilidad de los patrones obtenidos y la capacidad dediscriminacin entre especies y entre los individuos pertenecientes a la misma especie ypoblacin.

Los resultados obtenidos muestran la diferente capacidad de deteccin de poliformismode algunos partidores (Figura 1 ). De los 20 partidores analizados, 17 detectaron bandasde tamao especfico para cada especie. Se observ adems que en menor proporcinambas especies comparten bandas de idntico tamao molecular.

En roble el nmero de bandas amplificadas por partidor fluctu entre 4 y 12. Para los 340individuos de esta especie, se obtuvo un total de 158 bandas, de las cuales un 79%fueron polimrficas. Por otro lado, en raul se obtuvo entre 4 y 14 bandas por partidor.Para los 110 individuos analizados de esta especie se obtuvo un total de 145 bandas, yun 56% de ellas detectaron polimorfismo.

42

Figura 1. Poliformismo de tres partidores, bandas especie especficas y bandas deidntico tamao para roble y raul

Indices de similitud gentica de roble

Cuando el anlisis de similitud gentica se realiz con todos los individuos de roble,incluyendo la zona macroclimtica centro y sur , los valores fluctuaron entre 0.73 y 0.82 yun promedio de 0.79 (Cuadro 3 ). Estos resultados indican que la diversidad gentica dela especie es bastante uniforme a travs del rea de distribucin geogrfica. Estos nivelesde diversidad son similares a los obtenidos en otros estudios realizados con RAPD enespecies forestales de polinizacin cruzada.

Cuando se analizaron los datos de roble, por zona macroclimtica (centro y sur) en formaseparada, los valores de los coeficientes de similitud fueron similares a los obtenidos en ladistribucin geogrfica total. En la macrozona centro, slo para una poblacin, Los ruiles,Cauquenes de la VII Regin se obtuvo un promedio de 0.90, lo cual indica un menorgrado de diversidad entre los individuos colectados en esta poblacin (Cuadro 4 ). El restode las poblaciones fluctuaron entre 0.72 y 0.88, con un promedio de 0.79. Para lamacrozona sur los coeficientes de similitud fluctuaron entre 0.72 y 0.88, con un promedioidntico a la macrozona centro de 0.79 (Cuadro 5 ).

43

Cuadro 3 - Indices de similitud de Nothofagus obliqua chilenas y argentinas determinados por RAPD. Promedio porpoblacin (10 individuos)

Poblacin Regin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34

Los Ruiles VII-Cauquenes 0.8784

Quirihue VIII-uble 0.78 0.85

Cayumanqui VIII-Concep. 0.80 0.79 0.88

Curanilahue VIII-Arauco 0.77 0.78 0.79 0.85

L. Lanalhue VIII-Arauco 0.77 0.80 0.80 0.80 0.87

Pichipillahun IX-Malleco 0.72 0.76 0.76 0.75 0.77 0.86

Victoria IX-Malleco 0.79 0.79 0.80 0.79 0.80 0.75 0.86

Vilches VII-Talca 0.78 0.78 0.79 0.78 0.78 0.73 0.78 0.86

Quepe IX-Cautn 0.78 0.78 0.81 0.78 0.79 0.75 0.80 0.77 0.87

Bullileo VII-Linares 0.75 0.74 0.76 0.75 0.76 0.73 0.76 0.75 0.77 0.86

R. N. uble VIII-uble 0.76 0.77 0.78 0.75 0.75 0.74 0.77 0.75 0.76 0.76 0.83

Ralco VIII-Bo-Bo 0.79 0.81 0.80 0.79 0.80 0.76 0.78 0.79 0.79 0.74 0.77 0.86

Recinto VIII-uble 0.78 0.80 0.81 0.80 0.80 0.77 0.81 0.80 0.79 0.77 0.79 0.80 0.88

Santa Brbara VIII-Bo-Bo 0.77 0.78 0.79 0.81 0.79 0.74 0.80 0.78 0.79 0.75 0.75 0.78 0.79 0.85

Cuesta Lastarria IX-Cautn 0.78 0.77 0.79 0.79 0.78 0.74 0.81 0.78 0.80 0.76 0.77 0.79 0.80 0.79 0.85

Cruces X-Valdivia 0.79 0.79 0.81 0.79 0.80 0.73 0.79 0.79 0.80 0.76 0.76 0.79 0.79 0.78 0.77 0.88

Llancacura X-Valdivia 0.78 0.80 0.81 0.81 0.81 0.77 0.81 0.78 0.81 0.76 0.78 0.81 0.82 0.81 0.82 0.79 0.88

Purranque X-Osorno 0.76 0.80 0.79 0.78 0.82 0.75 0.78 0.79 0.76 0.75 0.75 0.79 0.79 0.76 0.77 0.79 0.80 0.86

Malalhue IX-Malleco 0.77 0.81 0.80 0.79 0.82 0.76 0.80 0.79 0.79 0.76 0.77 0.79 0.80 0.78 0.79 0.82 0.81 0.84 0.89

Futrono X-Valdivia 0.76 0.77 0.79 0.80 0.79 0.76 0.78 0.76 0.79 0.75 0.77 0.78 0.80 0.79 0.79 0.77 0.82 0.76 0.77 0.85

Rupanco X-Osorno 0.77 0.80 0.80 0.79 0.81 0.74 0.79 0.79 0.78 0.76 0.75 0.78 0.80 0.77 0.77 0.82 0.80 0.83 0.84 0.77 0.88

Melipeuco IX-Cautn 0.77 0.78 0.76 0.77 0.75 0.72 0.74 0.77 0.74 0.71 0.74 0.79 0.77 0.76 0.76 0.76 0.78 0.76 0.76 0.76 0.75 0.85

L.Galletu IX-Malleco 0.77 0.79 0.80 0.77 0.78 0.75 0.78 0.79 0.79 0.75 0.76 0.79 0.79 0.78 0.77 0.78 0.80 0.79 0.80 0.77 0.80 0.75 0.86

Cunco IX-Cautn 0.78 0.77 0.79 0.79 0.77 0.73 0.80 0.77 0.78 0.75 0.78 0.78 0.80 0.78 0.81 0.78 0.81 0.76 0.78 0.78 0.77 0.75 0.77 0.85

L. Colico IX-Cautn 0.79 0.80 0.80 0.79 0.80 0.74 0.80 0.79 0.79 0.77 0.76 0.80 0.80 0.79 0.79 0.80 0.80 0.80 0.81 0.77 0.80 0.76 0.80 0.78 0.87

Curarrehue IX-Cautn 0.77 0.77 0.78 0.77 0.78 0.74 0.78 0.77 0.77 0.75 0.77 0.77 0.78 0.78 0.78 0.80 0.78 0.78 0.80 0.77 0.79 0.77 0.77 0.76 0.80 0.86

Choshuenco X-Valdivia 0.79 0.78 0.79 0.79 0.79 0.73 0.80 0.78 0.80 0.74 0.76 0.80 0.79 0.80 0.79 0.80 0.81 0.78 0.80 0.79 0.78 0.78 0.78 0.79 0.80 0.78 0.86

Llifn X-Valdivia 0.81 0.81 0.80 0.79 0.80 0.75 0.80 0.80 0.79 0.76 0.78 0.82 0.80 0.79 0.80 0.80 0.80 0.81 0.82 0.78 0.79 0.79 0.79 0.80 0.81 0.80 0.81 0.88

Huahum Argentina 0.75 0.75 0.77 0.78 0.76 0.73 0.77 0.76 0.76 0.73 0.75 0.77 0.80 0.76 0.79 0.76 0.79 0.75 0.77 0.76 0.77 0.75 0.76 0.78 0.76 0.75 0.76 0.77 0.85

Las lagunas Argentina 0.73 0.75 0.75 0.76 0.73 0.73 0.75 0.76 0.75 0.74 0.75 0.75 0.77 0.76 0.76 0.75 0.77 0.72 0.73 0.76 0.74 0.74 0.74 0.76 0.74 0.74 0.74 0.75 0.77 0.82

Quilln Argentina 0.77 0.78 0.79 0.80 0.78 0.77 0.80 0.79 0.79 0.76 0.77 0.80 0.82 0.79 0.79 0.79 0.81 0.76 0.77 0.78 0.78 0.76 0.78 0.80 0.78 0.76 0.77 0.78 0.81 0.80 0.89

Quilln 2 Argentina 0.78 0.80 0.81 0.81 0.79 0.78 0.81 0.80 0.79 0.76 0.77 0.81 0.83 0.80 0.80 0.80 0.82 0.79 0.80 0.78 0.81 0.77 0.79 0.81 0.80 0.77 0.79 0.80 0.82 0.79 0.85 0.89

Quilaquina Argentina 0.75 0.77 0.78 0.79 0.77 0.76 0.79 0.78 0.79 0.74 0.75 0.77 0.79 0.79 0.79 0.79 0.80 0.76 0.78 0.78 0.78 0.76 0.77 0.79 0.77 0.78 0.78 0.77 0.80 0.78 0.82 0.83 0.85

Piloln Argentina 0.78 0.78 0.79 0.79 0.76 0.76 0.79 0.77 0.79 0.76 0.77 0.79 0.80 0.78 0.79 0.78 0.80 0.76 0.77 0.77 0.78 0.77 0.77 0.79 0.78 0.77 0.78 0.79 0.80 0.78 0.83 0.82 0.80 0.85

44

Cuadro 4 - Indices de similitud de Nothofagus obliqua chilenas del macroclimacentro determinados por RAPD. Promedio por poblacin (10 individuos)

Cuadro 5 - Indices de similitud de Nothofagus obliqua chilenas y argentinasdeterminados por RAPD. Promedio por poblacin (10 individuos)

Agrupacin de poblaciones de roble mediante anlisis de RAPD

En el dendrograma generado por los coeficientes de similitud (Fig. no includa) se apreciuna distribucin de los individuos, independiente a su origen geogrfico. La agrupacin deindividuos de una misma poblacin, y a una zona climtica fue baja. Sin embargo, en eldendrograma que incluy slo las poblaciones de la zona macroclima centro, se observuna mayor tendencia a la agrupacin de individuos pertenecientes a la mismaprocedencia (Fig. 2). Poe ejemplo, Los Ruiles, Recinto, Cayumanqui, Lago Lanalhue,Quepe, Victoria, R, Nac. uble, Bullileo y Pichipillahun presentaron una mayor tendenciaa agrupar los individuos pertenecientes a sus poblaciones.

Poblacin Regin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Los Ruiles VII-Cauquenes 0.878

Quirihue VIII-uble 0.78 0.85

Cayumanqui VIII-Concep. 0.80 0.79 0.88

Curanilahue VIII-Arauco 0.77 0.78 0.79 0.85

L. Lanalhue VIII-Arauco 0.77 0.80 0.80 0.80 0.87

Pichipillahun IX-Malleco 0.72 0.76 0.76 0.75 0.77 0.86

Victoria IX-Malleco 0.79 0.79 0.80 0.79 0.80 0.75 0.86

Vilches VII-Talca 0.78 0.78 0.79 0.78 0.78 0.73 0.78 0.86

Quepe IX-Cautn 0.78 0.78 0.81 0.78 0.79 0.75 0.80 0.77 0.87

Bullileo VII-Linares 0.75 0.74 0.76 0.75 0.76 0.73 0.76 0.75 0.77 0.86

R. N. uble VIII-uble 0.76 0.77 0.78 0.75 0.75 0.74 0.77 0.75 0.76 0.76 0.83

Ralco VIII-Bo-Bo 0.79 0.81 0.80 0.79 0.80 0.76 0.78 0.79 0.79 0.74 0.77 0.86

Recinto VIII-uble 0.78 0.80 0.81 0.80 0.80 0.77 0.81 0.80 0.79 0.77 0.79 0.80 0.88

Santa Brbara VIII-Bo-Bo 0.77 0.78 0.79 0.81 0.79 0.74 0.80 0.78 0.79 0.75 0.75 0.78 0.79 0.85

Poblacin Regin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Cuesta Lastarria IX-Cautn 0.85

Cruces X-Valdivia 0.77 0.88

Llancacura X-Valdivia 0.82 0.79 0.88

Purranque X-Osorno 0.77 0.79 0.80 0.86

Malalcahuello IX-Malleco 0.79 0.82 0.81 0.84 0.89

Futrono X-Valdivia 0.79 0.77 0.82 0.76 0.77 0.85

Rupanco X-Osorno 0.77 0.82 0.80 0.83 0.84 0.77 0.88

Melipenco IX-Cautn 0.76 0.76 0.78 0.76 0.76 0.76 0.75 0.85

L.Galletu IX-Malleco 0.77 0.78 0.80 0.79 0.80 0.77 0.80 0.75 0.86

Cunco IX-Cautn 0.81 0.78 0.81 0.76 0.78 0.78 0.77 0.75 0.77 0.85

L. Colico IX-Cautn 0.79 0.80 0.80 0.80 0.81 0.77 0.80 0.76 0.80 0.78 0.87

Curarrehue IX-Cautn 0.78 0.80 0.78 0.78 0.80 0.77 0.79 0.77 0.77 0.76 0.80 0.86

Choshuenco X-Valdivia 0.79 0.80 0.81 0.78 0.80 0.79 0.78 0.78 0.78 0.79 0.80 0.78 0.86

Llifn X-Valdivia 0.80 0.80 0.80 0.81 0.82 0.78 0.79 0.79 0.79 0.80 0.81 0.80 0.81 0.88

Huahum Argentina 0.79 0.76 0.79 0.75 0.77 0.76 0.77 0.75 0.76 0.78 0.76 0.75 0.76 0.77 0.85

Las lagunas Argentina 0.76 0.75 0.77 0.72 0.73 0.76 0.74 0.74 0.74 0.76 0.74 0.74 0.74 0.75 0.77 0.82

Quilln Argentina 0.79 0.79 0.81 0.76 0.77 0.78 0.78 0.76 0.78 0.80 0.78 0.76 0.77 0.78 0.81 0.80 0.89

Quilln 2 Argentina 0.80 0.80 0.82 0.79 0.80 0.78 0.81 0.77 0.79 0.81 0.80 0.77 0.79 0.80 0.82 0.79 0.85 0.89

Quila Quina Argentina 0.79 0.79 0.80 0.76 0.78 0.78 0.78 0.76 0.77 0.79 0.77 0.78 0.78 0.77 0.80 0.78 0.82 0.83 0.85

Piloln Argentina 0.79 0.78 0.80 0.76 0.77 0.77 0.78 0.77 0.77 0.79 0.78 0.77 0.78 0.79 0.80 0.78 0.83 0.82 0.80 0.85

45

Figura 2 - Dendrograma de poblaciones de roble, pertenecientesal macroclima centro

Cuando el dendrograma incluy slo las poblaciones del macroclima sur, se observ unaagrupacin preferencial de las poblaciones provenientes de Argentina, en la parte superiordel dendrograma. Sin embargo el nivel de diversidad gentica dentro de este cluster fuesimilar a las otras agrupaciones formadas por las poblaciones de origen chileno.

Un grupo intermedio estuvo conformado por individuos de origen chileno, se observalgn grado de agrupamiento entre individuos de la misma poblacin (Fig. 3 ). Un tercergrupo en la parte inferior del dendrograma estuvo integrado por roble proveniente deArgentina y en forma integrada se agrup con roble de origen chileno.

0.73 0.79 0.86 0.92 0.99

R100MW

R1 R29 R30 R138 R36 R136 R39 R2 R10 R8 R6 R3 R5 R4 R7 R9 R11 R18 R112 R115 R19 R20 R12 R129 R13 R14 R127 R123 R124 R128 R126 R26 R28 R67 R68 R64 R32 R125 R130 R21 R24 R25 R22 R23 R27 R60 R94 R102 R33 R44 R45 R47 R46 R50 R49 R40 R133 R63 R134 R131 R137 R70 R111 R113 R116 R118 R119 R35 R31 R38 R62 R139 R140 R34 R71 R72 R75 R78 R80 R79 R74 R77 R76 R121 R122 R81 R83 R84 R82 R86 R87 R89 R88 R90 R85 R103 R37 R132 R135 R114 R120 R117 R61 R69 R66 R65 R15 R16 R17 R41 R48 R42 R43 R101 R105 R106 R107 R104 R109 R110 R91 R92 R95 R97 R98 R100 R99 R93 R96 R73 R51 R52 R53 R54 R55 R56 R57 R58 R59 R108

Recinto

L. Lanalhue

Cayumanqui

Quepe

Victoria

Reserv. Nac. Nuble

Pichipillahun

Bullileo

Sta. BrbaraCayumanquiLos Ruiles

Los RuilesQuirihue, Recinto,Ralco

Victoria, Bullileo, R.N.uble

Victoria, S. Barb.,

Quepe

R.N. uble

LanalhueQuirihue

Ralco

uble,, Curanilahue, S. Barbara

Curanilahue, S.Barb.,

Cayumanqui, Victoria,Recinto,Curanilahue

Ralco

COEFICIENTE DE JACARD

46

Figura 3 - Dendrograma de poblaciones de roble, de origen chileno y argentino,

pertenecientes al macroclima sur

Indices de similitud gentica de raul

Cuando el anlisis de similitud gentica se realiz con todos los individuos de raul,incluyendo la zona macroclimtica centro y sur , los valores fluctuaron entre 0.78 y 0.83 yun promedio de 0.84 (Cuadro 6 ). Estos resultados indican que la diversidad gentica dela especie es bastante uniforme a travs del rea de distribucin geogrfica. Estos nivelesde diversidad son similares a los obtenidos en roble, con los mismos partidores de RAPD.Adems estn dentro de valores de similitud gentica de otras especies de polinizacincruzada.

0.68 0.75 0.83 0.90 0.97

R100MW

R1 R99 R104 R139 R111 R113 R2 R145 R146 R15 R98 R178 R171 R179 R172 R177 R160 R161 R165 R162 R175 R170 R163 R166 R174 R199 R169 R144 R148 R173 R149 R197 R176 R24 R180 R181 R151 R164 R192 R193 R186 R188 R183 R190 R130 R184 R187 R185 R100 R200 R198 R168 R142 R143 R147 R194 R196 R7 R30 R167 R21 R26 R29 R27 R28 R23 R52 R8 R9 R10 R51 R59 R92 R3 R5 R131 R37 R22 R133 R129 R132 R136 R134 R80 R121 R105 R115 R118 R138 R124 R126 R128 R125 R35 R110 R106 R107 R82 R108 R102 R103 R135 R137 R11 R68 R70 R12 R16 R17 R19 R20 R14 R13 R32 R41 R44 R49 R42 R45 R46 R43 R50 R48 R33 R62 R66 R61 R47 R88 R64 R65 R67 R69 R101 R63 R34 R31 R38 R40 R39 R25 R127 R75 R78 R53 R123 R54 R60 R56 R96 R116 R140 R58 R112 R114 R119 R120 R117 R36 R72 R73 R76 R79 R74 R195 R81 R86 R84 R85 R87 R83 R89 R90 R4 R95 R93 R94 R6 R91 R152 R189 R191 R154 R155 R156 R109 R157 R158 R159 R182 R55 R57 R18 R71 R141 R97 R150 R122 R77 R153

Quiln

Hua Hum

Quilaquina

Piloln

L. Galletu

Cuesta LastarriaCruces, ValdLlancacuraPurranqueMalalcahuello

FutronoRupancoL GalletuLlifnChoshuenco

Cuesta L., Cunco,L.Colico,Curarrehue

Cuesta L., Cruces,Melipeuco

Cunco,Choshuenco

, Melipeuco

Las Lagunas

L.Colico

COEFICIENTE DE JACARD

Curarrahue

Cunco, Choshuenco,Melipeuco

Hua hum, L. Lag, Piloln.

Melipeuco, Galletu, Cuesta L.

11A4C4C5C5C5C

7D7D13A13A11A

13A

11A

47

Cuadro 6 - Indices de similitud gentica entre poblaciones de N. alpina provenientesde las zonas macroclimticas centro y sur de Chile

Macrorea Procedencia Poblacin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11SUR 5C Las trancas 1.00CENTRO 8A E. Bullileo 0.79 1.00CENTRO 9A Sta Brbara 0.83 0.82 1.00CENTRO 9A Jauja 0.79 0.83 0.80 1.00CENTRO 8A Radal 7 tazas 0.80 0.80 0.80 0.78 1.00SUR 5C Huellusca 0.80 0.82 0.81 0.79 0.86 1.00SUR 11A Curarrehue 0.78 0.80 0.78 0.79 0.80 0.81 1.00SUR 13A Releco 0.78 0.82 0.77 0.80 0.79 0.80 0.83 1.00SUR 11A Malalcahuello 0.80 0.80 0.79 0.78 0.80 0.81 0.82 0.82 1.00CENTRO 3C Pichipillahun 0.82 0.80 0.83 0.79 0.81 0.81 0.78 0.80 0.79 1.00CENTRO 9A Recinto 0.81 0.80 0.81 0.78 0.78 0.81 0.82 0.80 0.79 0.79 1.00

Cuando se analizaron los datos de raul, separadamente para las zonas macroclimticascentro y sur. Los valores de los coeficientes de similitud obtenidos en la distribucingeogrfica central fluctuaron entre 0.78 y 0.83, mientras que el promedio fue de 0.86(Cuadro 7 ). Mientras que en la zona macroclimtica sur, los coeficientes de similitudfluctuaron entre 0.78 y 0.83, con un promedio casi idntico a la macrozona centro de 0.87(Cuadro 8 ).

Cuadro 7 - Indices de similitud gentica entre poblaciones de N. alpina provenientesde la zona macroclimtica centro de Chile.

Macrorea Procedencia Poblacin 1 2 3 4 5 6CENTRO 9 Recinto, uble 1.00CENTRO 3C Pichipillahun, Malleco 0.79 1.00CENTRO 8 Radal 7 tazas, Curic 0.78 0.81 1.00CENTRO 8 Embalse Bullileo, Linares 0.80 0.80 0.80 1.00CENTRO 9 Santa Brbara, Los Angeles 0.81 0.83 0.80 0.82 1.00CENTRO 9 Jauja, Malleco 0.78 0.79 0.78 0.83 0.80 1.00

Cuadro 8 - Indices de similitud gentica entre poblaciones de N. alpina provenientesde la zona macroclimtica sur de Chile.

Macrorea Procedencia Poblacin 1 2 3 4 5SUR 5C Las trancas, Valdivia 1.00SUR 5C Huellusca, Osorno 0.80 1.00SUR 11 Curarrehue, Cautn 0.78 0.81 1.00SUR 13 Releco, Valdivia 0.78 0.80 0.83 1.00SUR 11 Malalcahuello, Malleco 0.80 0.81 0.82 0.82 1.00

Agrupacin de poblaciones de raul mediante anlisis de RAPD

En el dendrograma generado por los coeficientes de similitud de raul provenientes de losmacroclimas centro y sur (Fig. 4 ), se apreci una distribucin, en los grupos inferiores deldendrograma, dependiente del origen geogrfico. El grupo superior incluy individuos deambas zonas macroclimticas.

48

Figura 4 - Dendrograma de poblaciones de raul chilenoperteneciente al macroclima sur

Cuando el anlisis de agrupamiento se realiz con los datos generados por laspoblaciones de raul del macroclima central, se observ una fuerte tendencia a que losindividuos provenientes de una misma poblacin se agruparan (Fig. 5 ). Por ejemplo, paralas poblaciones Radal 7 tazas, los 10 individuos analizados se agruparon en un cluster, enla rama intermedia del dendrograma. Adems, las poblaciones (puntos de muestreo)Radal 7 tazas y Embalse Bullileo, Jauja y Recinto, pertenecientes a la misma regin deprocedencia y zona macroclimtica se agruparon en el mismo cluster. Estas procedenciasinvolucran individuos de la regin de muestreo andina (A). Pichipillahun, procedencia dela cordillera de la costa se agrup con Santa Brbara de la regin andina y situada ambasen la misma latitud.

COEFICIENTE DE JACARD0.78 0.82 0.87 0.91 0.96

R100MW

R1 R104 R109 R106 R2 R8 R9 R10 R6 R7 R3 R92 R21 R28 R101 R22 R23 R24 R25 R26 R27 R29 R30 R91 R93 R97 R94 R95 R98 R100 R96 R99 R103 R107 R4 R5 R41 R43 R47 R48 R55 R42 R44 R45 R49 R52 R51 R50 R46 R53 R54 R56 R57 R59 R58 R60 R11 R13 R12 R15 R18 R16 R14 R39 R17 R19 R20 R40 R71 R72 R31 R32 R33 R34 R37 R38 R35 R36 R102 R108 R105 R110 R61 R62 R65 R77 R75 R64 R69 R70 R68 R78 R66 R73 R80 R79 R74 R76 R63 R85 R82 R88 R81 R89 R90 R83 R84 R86 R67 R87

Pichipillahun

Releco

PichipillahunCurrareRadal 7 tazasReleco

Radal 7 tazas

CurrareReleco

PichipillahunJaujaRecintoBullileoSta. Brbara

Huellusca

Sta. Brbara

Releco

Las trancas

Huellusca

Las trancasCurrare

Malalcahuello

S

C

Coeficiente de Jacard

49

Figura 5 - Dendrograma de poblaciones de raul chileno pertenecienteal macroclima centro

Cuando el anlisis de agrupamiento se realiz con los datos generados por laspoblaciones de raul del macoclima sur, se observ tambin una clara tendencia a que losindividuos provenientes de una misma poblacin se agruparan (Fig. 6 ). Por ejemplo, paralas poblaciones Las Trancas, Rahue, Malalcahuello y Releco agruparon a la mayora delos individuos analizados (10). Las otras poblaciones analizadas tambin agruparon susindividuos, entremezclando robles provenientes de otras poblaciones, ejemplo Curarrehuey Releco.

Se observa adems una agrupacin entre poblaciones provenientes de regionesgeogrficas continuas, como son: Curarrehue y Releco, de la regin andina, 11A y 15A,respectivamente.

PICHIPILLAHUEN

RADAL 7TAZAS

RECINTO

JAUJA

EMBALSEBULLILEO

SANTABARBARA

COEFICIENTE DE JACARD

3C-C

9A-C

8A-C

8A-C

9A-C

9A-C

50

Figura 6 - Dendrograma de poblaciones de raul chileno pertenecienteal macroclima centro

Introgresin

Usando los partidores especie especficos para determinar y/o confirmar la presencia dehbridos naturales entre Roble y raul, se amplificaron los hbridos colectados del huertoHuillilemu. Existe una alta correlacin entre la identificacin morfolgica y la moleculardeterminada por los partidores de RAPD usados en este estudio (Fig. 7 ).

A nivel de las procedencias analizadas, se detect un 66,7% de hbridos, mientras que anivel de individuos se confirm en un 34,5%.

Figura 7 - Determinacin de hbridos mediante partidores especie especficos

LASTRANCAS

RAHUE

MALALCA-HUELLO

RELECO

RACU

COEFICIENTE DE JACARD

5C-S

5C-S

11A-S

11A-S

15-A

51

Uso de PCR-RFLP

El ADN citoplasmtico es de herencia materna y ha permitido estudiar la organizacingentica de centros de diversidad, establecer relaciones entre los genotipos cultivados ysus materiales silvestres ancestrales. La conservacin alta que presentan los organelosen la mayora de los vegetales ha permitido disear partidores universales que amplificanregiones no codificadoras y que intercalan dos regiones codificadoras.

Estas regiones pueden ser estudiadas por secuenciacin o digestin con un nmero deenzimas de restriccin para determinar el nmero de polimorfismos (RFLP-PCR). Paraestudiar la diversidad de las poblaciones clasificados en base a su fenotipo como hbridosentre roble-raul, y la direccin de introgresin, se establecieron los parmetros deamplificacin (PCR) y de restriccin con enzimas de corte frecuente (RFLP). En elproyecto se analizaron 31 individuos provenientes de poblaciones hbridas. Sin embargono fue posible determinar variabilidad ni direccin de introgresin, debido almonomorfismo presentado en las combinaciones generadas por lo 9 set de partidores y 8enzimas de restriccin utilizadas en el estudio.

Figura 8 - Patrones monomrficos de PCR-RFLP obtenidos con la combinacin delpartidor de cloroplasto 4 y Tha I

52

DIFERENCIACIN GENTICA DETECTADA CON MARCADORES DE ADN DECLOROPLASTO

COMPONENTE ARGENTINO

Metodologa

La metodologa utilizada en las diferentes etapas del Proyecto se halla descripta en formadetallada en las publicaciones cientficas, captulos en libros tcnicos y presentaciones aCongresos, resultado del presente estudio (Anexo 1 ).

1. RAULI

En base a un trabajo previo (Marchelli et al., 1998) se analizaron dos regionespolimrficas de ADN de cloroplasto en 20 poblaciones de Argentina y 11 de Chile. Deestas poblaciones se analizaron plntulas recin germinadas o yemas. Al no encontrarsevariacin intrapoblacional en el trabajo previo, la muestra se estableci entre dos y cuatroindividuos por poblacin, en funcin de lo establecido por Pons & Petit (1995). Lascombinaciones de primer/enzyma que detectaron variacin y fueron utilizadas son:DT/TaqI y FV/TaqI (Fig. 1.1 ).

Figura 1.1 - Ejemplo de polimorfismo encontrado con el primer FV y la enzyma TaqI

Se detectaron en total cinco haplotipos entre las poblaciones Argentinas y Chilenas(Cuadro 1.1 ). La distribucin geogrfica de los haplotipos present una marcadaestructuracin, separando aquellas poblaciones de la Cordillera de la Costa de lassituadas en la Cordillera de los Andes. A su vez, entre las poblaciones de cada Cordillerase evidenci una diferenciacin a nivel latitudinal (Fig. 1.2 ). Estos resultados sugieren laexistencia de mltiples refugios para la especie durante las ltimas glaciaciones. Por otrolado, la separacin de la Costa y los Andes apoya la permanencia de la especie enrefugios andinos, ubicados tanto en la ladera Este como en la Oeste.

53

Cuadro 1.1 - Descripcin de los cinco haplotipos detectados en Nothofagus nervosay poblaciones en los cuales se encontraron. Los fragmentos polimrficos se

marcaron en orden decreciente de peso molecular .

Figura 1.2 - Distribucin geogrfica de los haplotipos encontrados en poblacionesargentinas y chilenas de Nothofagus nervosa.

Haplotipo FV/TaqI DT/TaqI Poblaciones

I 3 2 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 Andes Sur

II 4 3 16, 17, 18, 19, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 Andes Norte

III 1 2 21 Andes Centro (Neltume)IV 2 1 29 Costa Sur (Chol Chol)V 4 2 30 Costa Norte (Nahuelbuta)

ReferencesHaplotype IHaplotype IIHaplotype IIIHaplotypeIVHaplotype V

54

2. ROBLE

Para el estudio a travs de cpADN se utiliz tejido foliar de plntulas obtenidas envivero (invernculo y cantero) para este fin. Para este anlisis se evaluaron 10individuos en dos poblaciones con el objetivo de verificar la posible existencia devariacin intrapoblacional. Debido a que se comprob la ausencia de variacinintrapoblacional, el tamao muestral se redujo a 5 individuos para el resto de laspoblaciones (ej. MTYS and SPERISEN, 2001). Para este anlisis se aplic elmtodo conocido como PCR-RFLP o CAPS (Cleaved Amplified PolymorphicSequence) que consiste en la digestin del producto de amplificacin con enzimasespecficas de restriccin para luego visualizarlo en gel de acrilamida con tincincon bromuro de etidio (CERVERA et al., 2000). El mtodo, que cuenta con laventaja de no demandar del previo conocimiento de la secuencia del ADN de laespecie bajo estudio, utiliza primers universales. En este caso, se utiliza un set deprimers desarrollado para la amplificacin de regiones no codificantres de ADN decloroplasto en plantas (TABERLET et al., 1991; DEMESURE et al., 1995;DUMOLIN-LPEGUE et al., 1997). Este anlisis permiti realizar una diferenciacingentica en las poblaciones analizadas a partir de haplotipos, que posibilita lainferencia de localizacin de posibles refugios glaciarios y reconstruccin de rutasmigratorias de la especie luego de la retraccin de los hielos.

Los resultados hallados a partir de este estudio se detallan en el Cuadro 2.1 , endonde el nmero corresponde al nombre con el que se identificaron las bandassobre el gel de acrilamida.

Tabla 2.1 - Haplotipos por poblacin para las tres combinaciones primer/enzima

POBLACIN HaplotipoDT/Taq I DT/HaeIII FV/TaqI

Las Lagunas 13 2 2Quilln 6 3 1 4Quilln 7 3 1Quilln 8 3 1orquinco 9 3 1orquinco 10 3 1orquinco 11 3Pilolil 12 3 1 4Lcar Yuco 2 2Lcar Nonthu 3 2 2Lcar Hua Hum 4 2 2Lcar Po Protto 5 2 2Lcar Quila Quina 14 2 2 22 C (Cord. Costa) 33 C (Cord. Costa) 3 14 C (Cord. Costa) 36 D (Valle Long.) 3 18 A (Cord. Andes) 29 A (Cord. Andes) 211 A (Cord. Andes) 2 213 A (Cord. Andes) 2

En el Cuadro 2.2 se resumen a nivel de cuenca (poblaciones argentinas) y regin(poblaciones chilenas), los haplotipos encontrados.

55

Cuadro 2.2 - Haplotipos poblaciones Nothofagus obliqua por cuenca/regin

Cuenca/Regin DT/TaqI DT/HaeIII FV/TaqIEPULAFQUEN 2 2ORQUINCO 3 1PILOLIL 3 4QUILLN 3 1 4LCAR 2 2 2CORD. COSTA 3 1VALLE MEDIO 3 1CORD. ANDES (Chile) 2 2

Tanto las poblaciones de distribucin argentina, como las de distribucin chilena,presentaron, para las combinaciones primer/enzima DT/TaqI, DT/HaeIII y FV/TaqI, losmismos haplotipos descriptos por Marchelli et al. (1998) para Nothofagus nervosa. Laspoblaciones argentinas de la especie, al igual que las de Nothofagus nervosa mostraronun patrn de distribucin latitudinal respecto al Volcn Lann, excepto para Lagunas deEpulafquen. Las poblaciones chilenas presentaron un patrn de tipo longitudinal, asociadoa la regin geogrfica de localizacin de las poblaciones. El anlisis de las poblaciones ensu conjunto a partir de los resultados hallados hasta el presente posibilit observar quetanto las poblaciones chilenas de la Cordillera de los Andes (norte, centro y sur), como lasde distribucin sur en Argentina, presentaron el haplotipo que Marchelli nombra como suren su estudio. Por otro lado, las poblaciones de la Cordillera de la Costa y ValleLongitudinal comparten haplotipo con las poblaciones de distribucin norte en Argentina,excepcin hecha para poblacin Epulafquen. Estos resultados, con haplotiposcompartidos por las distribuciones en cada pas nos permiten inferir posibles refugiosglaciarios comunes, principalmente en lo que se refiere al haplotipo sur. Las poblacionesnorte de Argentina pudieron haberse originado a partir de refugios de localizacin este,debido a la gran distancia respecto al Valle Medio y Cordillera de la Costa, junto a losresultados arrojados por el presente estudio a nivel isoenzimico. La Figura 2.1 muestraen forma esquemtica a distribucin geogrfica de los haplotipos hallados en laspoblaciones analizadas.

56

Figura 2.1 - Mapa distribucin haplotipos Nothofagus

ReferenciasDistribucin haplotipos poblaciones Nothofagus obliqua combinacin Primer-Enzima DT/TaqIbanda 2: amarillobanda 3: marrn

57

CONSERVACIN DE SEMILLA DE MEDIOS HERMANOS Y ESTABLECIMIENTO DEENSAYOS DE PROGENIE

INTRODUCCION

La diversidad gentica es la piedra angular para la seleccin y el mejoramiento futuros yes, a la vez, fundamental para permitir a los rboles adaptarse a cambios climticos o anuevas plagas. Los productos aportados por los rboles apoyan la calidad de vida demillones de personas, por lo cual estos recursos genticos deben ser reconocidos comoun recurso natural que requiere ser conservado.

El mtodo natural de conservacin es el manejo sostenible de los bosques, en aquelloscasos en que an no han sido objeto de erosin gentica. Como lo anterior no es lanorma, ya que una gran parte de los bosques naturales se encuentran en estadoavanzado de degradacin, es necesario recurrir a medidas especiales de conservacin.La aproximacin preferida para la conservacin de recursos genticos forestales es,normalmente, mantener el pool gentico en rodales vivientes, de modo que ellas puedanresponder a cambios climticos o del ambiente, en general, prosiguiendo el procesoevolutivo; lo anterior, en sus ecosistemas naturales, lo que constituye la conservacin insitu.

Lamentablemente, no siempre es posible aplicar el mtodo anterior. En muchos casos, laspoblaciones naturales estn bajo presin y existen probabilidades de que desaparezcan,debido a acciones antrpicas, preferentemente. En situaciones de alto riesgo para laspoblaciones naturales, es preciso recurrir a la estrategia ex situ; dentro de esta opcin, lamejor alternativa sera la realizacin de plantaciones a escala operacional, lo cual pondraa las especies as utilizadas en resguardo frente a una probable extincin. Pero no todaslas especies suelen ser plantadas masivamente, ya que algunas slo tienen valor deopcin; por lo tanto, como una respuesta a este problema, que es de carcter mundial, sehan desarrollado algunas estrategias, entre las cuales la conservacin de germoplasma yel establecimiento de procedencias y/o progenies aparecen como las ms probables deser ejecutadas en Chile.

La conservacin de germoplasma corresponde a preservacin gentica, en que se tomanmedidas anticipadamente, poniendo el recurso a cubierto de dao o peligro; en estasituacin, no opera la evolucin, por lo cual se acepta que no es un mtodo muyapropiado para las especies forestales. Es por ello que no se ha empleado masivamente,aunque deberan hacerse esfuerzos a partir de ahora, en que se cuenta con predictoresde longevidad para tales especies. Roble y raul son especies de semillas ortodoxas quepueden secarse hasta contenidos de humedad tan bajos como 6% y almacenarse a 18C por varias dcadas en envases sellados. Ensayos realizados en Inglaterra (Gosling,com. pers.) indican que raul, a 6% de contenido de humedad, almacenado a 2C hamantenido inalterable su viabilidad por 17 aos. En el caso de roble, con 8,7% decontenido de humedad y almacenado a 2C, han logrado el mismo nivel de xito que enraul, en un horizonte de 12 aos.

Sin duda que el mtodo ms aconsejable en el caso de especies forestales es elestablecimiento de unidades ex situ, entre las cuales los ensayos de progenies aparecencomo las ms importantes por la variada aplicacin que ellos tienen. En efecto, al igualque en todos los cultivos, en especies forestales como roble y raul el objetivo principal deestos ensayos es la determinacin de parmetros gentico-estadsticos como laheredabilidad y las aptitudes combinatorias, a la vez que permiten la seleccin genticahacia atrs y hacia delante, al ser considerados como poblaciones base en un

58

programa de mejoramiento gentico. Pero, en el presente, tal vez un rol tan importantecomo el anterior, sea el de la conservacin del material establecido, sobre todo si serealizan a partir de bases genticas adecuadas, como un nmero mnimo de progenitoresrepresentados, una cantidad de medios hermanos que garantice selecciones futuras, y talvez lo ms importante, que se establezcan sobre diferentes tipos de condicionesambientales emulando el sistema de mejora basado en poblaciones mltiples. En el casode Chile, el esfuerzo ms notable en esta rea, antes del Proyecto FONTAGRO, es elensayo de progenies de 27 medios hermanos de raul, establecido al amparo del ProyectoFONDEF Mejoramiento Gentico para Especies de Nothofagus de Inters Econmico.Cada una de estas 27 madres est representada por 30 hijos (medios hermanos entre s),en un diseo de bloques completos al azar, utilizando parcela de rbol individual, con 30repeticiones.

Objetivos

1. Constituir una poblacin base con estructura familiar conocida para efectuar lasselecciones que darn origen a la siguiente generacin de mejoramiento

2. Entregar informacin respecto al comportamiento diferencial que exhiban las distintasprocedencias y progenies consideradas en la evaluacin

3. Permitir la evaluacin de parmetros genticos que orienten la estrategia demejoramiento gentico de largo plazo

4. Entregar informacin del desempeo en terreno del material ensayado, el cualcombinado con la informacin que se obtenga por los anlisis moleculares permitiruna definicin mas depurada de las regiones de procedencia y contribuir a unadecuado ordenamiento territorial y gentico de este recurso en Chile.

MATERIALES Y MTODOS

La semilla de las poblaciones de roble y raul fueron colectadas en las 14 zonas deprocedencia de roble y en las siete zonas de procedencia de raul. Esta actividad serealiz durante tres temporadas debido al aersmo y a la baja calidad de la semillacolectada, principalmente por problema de dao de insectos y bajo poder de germinacin.La semilla colectada durante la temporada 1998/1999 y 1999/2000 fue destinadacomplemente a producir plantas para los ensayos de progenies y la semilla colectada elao 2002/2003 se almacenar en una cmara de fro para su conservacin. En el ao2002/2003 se colect semilla de una poblacin por regin de procedencia en roble(Cuadro 1 ) y raul (Cuadro 2 )

59

Cuadro 1 - Regin de procedencia, poblacin, nmero de rboles y semilla (g) porao de colecta de roble en Chile.

1998/1999 1999/2000REGIN Punto o poblacin N

arbolesSemilla

(g)N

rbolesSemilla

(g) 1.Til-Til 10 320 7 771 2. Lampa 0 0 10 565

1-C

3. Alhue 7 22,5 7 629 4. Alto colorado 7 54 7 508 5. R. N. Los Ruiles 10 118 7 5426.1 Ninhue 10 633 - -

2-C

6.2 Quirihue 11 446 - - 7. Cayumanqui 10 195 7 212 8. Curanilahue 10 167 7 316 9. L. Lanalhue 10 264 - -

3-C

10. Pichipillahun 10 482 - -11. Cuesta Lastarria 10 214 - -4-C12. Cruces 11 1552 - -13. Llancacura 10 1386 - -14. Rio negro 10 3264 - -

5-C

15. Purranque 10 2708 - -16. Victoria 10 456 - -6-D17. Quepe 10 467 - -18. Malalhue 4 250 - -19. Futrono 10 1130 - -

7-D

20. Rupanco 10 790 - -21. Sierras de Bellavista 7 78 7 101522. Alto Lircay 10 116 6 29223. Altos de Vilches 10 167 - -24. Vilches 10 142 1 45

8-A

25. Bullileo 10 81 7 56826. R. Nac. uble 10 565 - -27. Ralco 10 168 3 37228. Recinto 10 497 - -

9-A

29.Sta. Brbara 10 517 - -10-A 30. Loncopu, Arg. 0 0 - -

31. L. Galletue 9 116 - -32. Cunco 10 473 - -33. L. Colico 10 188 - -

11-A

34. Curarrehue 10 344 - -35. Paso Pino Hachado, Arg 0 0 - -12-A36. Alumin, Arg. 0 0 - -37. Choshuenco 10 605 - -13-A38. Llifn 10 331 - -

14-A 39. Lago Lacar, Arg. 0 0 - -TOTAL 336 19.306 83 6.337

60

Cuadro 2 - Regin de procedencia, poblacin, nmero de rboles y semilla (g) porao de colecta de raul en Chile

1998/1999 1999/2000REGIN Punto N

arbolesSemilla

(g)N

arbolesSemilla

(g) 1. Quebrada Bellavista 0 0 2. Cord. Nahuelbuta 10 107 7 149

3-C

3. Pichipillahun 10 130 2 102 4. Las trancas 10 2875-C 5. Huellusca 10 244 6. Radal 7 Tazas 10 115 2 98 7. Vilches 10 63 1 78

8-A

8. Emb. Bullileo 10 85 9. Recinto 10 18310. Sta. Brbara 10 142 3 144

9-A

11.Jauja 10 150 2 13912. Malalcahuello 10 49 7 7813. Melipeuco 10 80 10 274

11-A

14. Curarrehue 10 14513- A 15. Releco 10 213 2 133

16. Neltume 1 35 9 14317. Arquilhue 0 0 2 44

14-A 18. Lago Lacar, Arg. 0 0TOTAL 131 2028 47 1.372

Las actividades de viverizacin, tratamientos germinativos, siembra y cuidados culturalesde las plantas producidas bajo condiciones de invernadero, se desarrollaron bajo lametodologa definida y aplicada por la Empresa Forestal Agrcola Monteguila S.A., en lasespecies de roble y raul.

La poca de siembra fue durante el mes de Septiembre del ao 1999, para de esta formaobtener plantas a finales de Junio del ao 2000, con un tamao variable entre 35 y 60 cm.de altura, y un dimetro de cuello entre 4 y 8 mm. Debido a la gran cantidad de familias yprogenies la siembra comenz en la segunda semana de Septiembre de 1999,extendindose hasta la tercera semana de Octubre.

Con este material se establecieron cinco ensayos de raul y tres de roble. Estos ensayosse establecieron en el patrimonio de Empresas forestales y en reas administradas por laCorporacin Nacional Forestal. En su instalacin se utilizaron las tcnicas silvcolasrecomendadas en un diseo experimental de Bloques Completos al Azar, con parcelas deuna planta (Single tree plot) y plantaciones en fajas para efectos de proteccin lateral. Enel establecimiento de los ensayos participaraon investigadores del INFOR, y laUniversidad Austral de Chile con la colaboracin de CONAF, y las Empresas Agrcola yForestal Taquihue Ltda, Forestal Neltume Carranco S.A, JCE Chile S.A.; y COFOMAPdirigidos por el Dr. Roberto Ipinza.

RESULTADOS

Los ensayos de progenie de roble y raul fueron ubicados en las regiones VIII y X (Cuadro3).

61

Cuadro 3 - Ubicacin geogrfica de los ensayos de progenie de roble y raul con lasemilla colectada con financiamiento del proyecto

Especie Predio Empresa Regin Provincia ComunaRoble Remeco For. Neltume Carranco S:A X Valdivia Panguipulli

Pumillahue CONAF X Valdivia LancoArquilhue Agrcola y Forestal Taquihue Ltda. X Valdivia Futrono

Raul El Morro JCE Chile Ltda VIII BioBio MulchnRemeco For. Neltume Carranco S:A X Valdivia PanguipulliPilmaiquen COFOMAP X Valdivia PanguipulliHuillilemu CONAF X Valdivia MariquinaArquilhue Agrcola y Forestal Taquihue Ltda. X Valdivia Futrono

CONCLUSIONES

1. El proyecto proporcion la semilla colectada en los aos 1998/1999 y 1999/2000 paraproducir varios cientos de plantas, las que fueron empleadas para la plantacin dediferentes ensayos de procedencia.

2. El financiamiento de las plantaciones fue obtenido de empresas pblicas y privadas.

3. Se espera en el futuro utilizar este material gentico para continuar con los estudiosmoleculares sobre diversidad gentica de estas especies y su posible uso enmejoramiento gentico.

4. La semilla colectada durante la temporada 2002/2003 se mantendr en cmara fracon propsitos de conservacin de estas especies. La colecta en esta temporadaincluy a una 11 poblaciones de roble y a seis procedencias de raul. En el futuro sepretende aumentar el nmero de poblaciones bajo estas condiciones.

COMPONENTE ARGENTINO: BANCO DE SEMILLAS

RAULI

Previamente al inicio del proyecto se contaba con semilla proveniente de 29 poblacionesdel rea de distribucin en Argentina. Durante el perodo de ejecucin del proyecto sesigui recolectando en tres poblaciones. Tambin se recolectaron semillas de rbolesindividuales pertenecientes a las zonas de Tromen (25 rboles), Lcar (20 rboles) yBaha Azul (25 rboles).

Parte de la semilla se utiliz en los anlisis de laboratorio, parte se sembr y parte seguard en freezer a -20 C como banco seminal. Las plantas obtenidas se instalaron enensayos de progenies y procedencias, lo cual tambin representa un banco gentico yposibilita estudios a futuro. Se cuenta con un total de cuatro ensayos, dos ubicados dentrodel rea natural de distribucin del Raul (Pucar, Yuco Alto) y dos por fuera de estadistribucin, en el Campo Forestal del INTA en Trevelin y en propiedad privada prxima alLago Meliquina.

Los Cuadros 1 y 2 muestran la cantidad de semilla almacenada en freezer.

62

Cuadro 1 - Cantidad de semillas de poblaciones de Raul almacenada en freezer

Poblacin Cantidad de semillas (g)4 8095 5936 165216 160520 102921 138523 236024 95126 68527 140128 88429 27330 64TOTAL 13.691

Cuadro 2 - Cantidad de semillas de individuos de Raul pertenecientes a dospoblaciones almacenada en freezer

Individuo CantidadT3 53T8 14T12 22T13 14T14 21T16 68T17 18T18 40T19 26T21 45T22 16T26 31T29 61BA1 11BA2 16BA4 15BA5 62BA6 54BA7 68BA8 38BA9 64BA10 20BA11 61BA12 22BA13 23BA14 68BA15 19BA16 69BA17 29BA18 73BA19 33BA20 34BA21 46BA22 27BA23 34BA24 6TOTAL 1.354

63

ROBLE

Se llevaron a cabo 3 cosechas sucesivas (aos 2000, 2001, 2002) a lo largo de laduracin del Proyecto en las 14 poblaciones de Nothofagus obliqua Roble Pelln, dedistribucin en Argentina. La metodologa consisti en la colocacin de redes a 1,5 m delsuelo antes de la cada de los frutos (meses enero - febrero). Se colocaron 10 redes porpoblacin, y estimando un aporte por red de 5-6 rboles, se infiere que 50-60 rbolescontribuyen en la produccin por rodal. Los datos de cantidad de semilla en gramos porpoblacin, correspondientes a los aos de cosecha 2000, 2001 y 2002 se presentan en elCuadro 3 .

Cuadro 3 - Registro de semilla Nothofagus obliqua almacenada

Poblacin Semilla (g)Bandurrias 1 2,00Yuco 2 4618,81Nonthu 3 688,86Hua Hum 4 1595,78Po Protto 5 1287,46Quilln 6 - Casa Guardaparque 248,93Quilln 7 - Corral de Bueyes 61,17Quilln 8 - Fonndo del Lago 58,15orquinco 9 - Pulmar 246,82orquinco 10 - Oeste Secc. 199,56orquinco 11 - Chumpiru 91,91Pilolil 12 1645,23Las Lagunas 13 16Quila Quina 14 97,46

TOTAL 10.858,14

El Banco de Semillas tambin incluye semilla de medio hermanos (semifratrias) de 38rboles madre, pertenecientes a las poblaciones Quila Quina (cuenca Lago Lcar) y Pilolil(cuenca Ro Alumin). Parte de esta semilla fue utilizada en el anlisis de control genticodonde se confirm el modo de herencia de los loci isoenzimticos hallados y la relacininequvoca entre fenotipo y genotipo. La semilla correspondiente tanto a poblacionescomo a familias de medio hermanos se conserva en cmara de fro (4C), limpia y enenvases plsticos para su utilizacin en el futuro. Como parte de la estrategia y poltica detrabajo de la Unidad de Gentica Forestal de EEA, INTA Bariloche, se cuenta en viverocon dos ensayos de Progenie: Las Lagunas de Epulafquen, con 25 familias representadasy Quila Quina con 12 familias (tamao de parcela: 20 individuos). Ambos ensayos selocalizan en las instalaciones del vivero de la EEA, en cantero, dispuestos con un diseode bloques al azar, que ser mantenido cuando sean llevados a campo.

64

DESARROLLO DE NUEVAS TECNOLOGAS

En INTA Bariloche durante los meses de abril y mayo de 2003 se llev a cabo unintercambio cientfico en el marco del Convenio INRA - INTA, en el Laboratoire deGntique et Amlioration des Arbres Forestiers, Cestas, INRA. El objetivo de la estadaconsisti en la identificacin de SSRs polimrficos en Nothofagus a partir de un nuevabatera de primers desarrollado para el gnero y primers desarrollados para Quercus,gnero emparentado. Se probaron 16 nuevos primers desarrollados para el gnero y 12desarrollados para Quercus robur roble europeo por el Dr. Caron (sin publicar) y 6desarrollados para Quercus robur (Kampfer et al., 1998) y Quercus petraea (Steinkellneret al., 1997) con tcnica de gel de acrilamida con tincin con nitrato de plata; 16 SSRsmarcados desarrollados para Quercus rubra Roble americano (Aldrich et al., 2002) fueronanalizados en secuenciador automtico (DNA Sequencer, Model 4000). De los 50 SSRsprobados, 8 resultaron polimrficos y se caracterizaron a travs de los parmetros nmerode alelos y hereocigosis observada. Se realiz el control gentico de 5 de los primers,confirmando de esta manera su modo de herencia codominante.

Investigacin adicional o complementaria

Los microsatlites son marcadores de gran utilidad para estudios de paternidad y flujognico, debido a sus caractersticas de hipervariables y codominantes. De estamanera, posibilitarn el estudio de flujo gnico en las poblaciones argentinas deNothofagus obliqua y Nothofagus nervosa necesario para entender la estructuragentica hallada a nivel de cuenca en este Proyecto, y que fue uno de los estmulospara la concrecin del trabajo en Francia. Asimismo, posibilitarn la continuacin delos estudios de hibridacin interespecfica Roble - Raul y su modelizacin, que seestn llevando a cabo en nuestra Unidad de Gentica Forestal del INTA EEABariloche.

Sera muy importante ampliar el muestreo de las poblaciones chilenas para completarel anlisis de la variacin gentica en cpDNA.

En INIA Quilamapu, se utiliz la tcnica de PCR-RFLP en forma adicional para ladeterminacin de hbridos y la direccin de introgresin. Sera importante continuarcon el uso de esta tcnica amplindola hacia el uso partidores de mitocondria yaumentando el nmero de enzimas de restriccin (ver informe N3).

En INIA Quilamapu, se estandariz el uso de SSR en algunos materiales de roble y raulchilenos. Con esta tecnologa se estudi la transferibilidad y estabilidad de amplificacinde 6 partidores de Quercus. Los resultados preliminares indicaron la posibilidad de usaralgunos de estos partidores en estudios de variabilidad gentica de Nothofagus (Verinforme N3).

Figura 1. Amplificacin de SSR provenientes de Quercus enroble ( ) y raul ( ).

Estndar de100 bp

65

IMPACTOS ESPERADOS

Manejo silvcola

Actualmente, y a partir del presente trabajo se cuenta con las primeras herramientasnecesarias para llevar a cabo un Programa de Conservacin y Manejo de los bosques deNothofagus obliqua y Nothofagus nervosa de Argentina y Chile, segn criterios genticos.Los conocimientos generados constituyen la base sobre la cual formular prescripciones dendole silvcola y de conservacin, tan necesarias para la regin. Por otro lado, tambin secuenta ahora con elementos bsicos sobre la influencia que podra tener el manejosilvcola en la dinmica poblacional. El caso concreto de la hibridacin entre ambasespecies es un punto muy importante a tener en cuenta al momento de manejar unbosque mixto. La alteracin en la proporcin de ambas especies favorece la hibridacin,lo cual llevara a una disminucin en la capacidad reproductiva y de supervivencia de lapoblacin. Asimismo, la diferenciacin entre poblaciones ubicadas dentro de una mismacuenca lacustre sugiere un flujo gnico no muy extensivo que tambin debe ser tenido encuenta al momento de disear un plan de manejo.

Conservacin de los Recursos Genticos Forestales

Cambio de estatus dentro de una zona del Parque Nacional LannLa zona del Lago Lcar (Zona de Reserva de Raul y Roble Pelln), Argentina, seencuentra actualmente bajo manejo silvcola. La gran diversidad y diferenciacingenticas con la presencia de alelos raros y exclusivos en la poblacin Hua Hum, al Oestede la cabecera del Lago Lcar llevaron a presentar un pedido de cambio de estatus deesta regin ante la Administracin de Parques Nacionales. Dicho pedido se encuentraactualmente en gestin en dicha institucin suspendindose de hecho hasta lacorrespondiente resolucin toda intervencin silvcola en el rea mencionada.

Fortalecimiento de las relaciones interinstitucionales

En Argentina, el presente proyecto permiti fortalecer las relaciones inter-institucionalesentre el INTA y la APN (Administracin de Parques Nacionales), dado que se trabaj enconjunto con el Departamento de Silvicultura de dicha institucin para la seleccin de laspoblaciones y las tareas de recoleccin de semillas. En estas ltimas tareas vale la penadestacar el trabajo realizado por el Cuerpo de Guardaparques de los Parques NacionalesLann y Nahuel Huapi.

En Chile, el proyecto fue un excelente mecanismo para lograr un mayor acercamiento conla empresa privada y con instituciones del sector pblico forestal como son CONAF,INFOR y Universitario (CEFOR). En este contexto el trabajo realizado con INTA, Barilochefue tambin muy productivo.

Valorizacin del recurso forestal nativo

Se logr una mayor valorizacin del recurso gentico forestal nativo por parte deproductores privados quienes se interesaron en la plantacin de Raul y Roble Pelln ensus propiedades.

En Chile, producto del acercamiento producido entre la empresa pblica y privada seiniciar en corto plazo una serie de reuniones tendientes a planificar y priorizar actividadesdestinadas a continuar con la evaluacin de estos recursos para su conservacin,mejoramiento gentico y aprovechamiento productivo.

66

Regulacin de la cosecha de semilla.

La instalacin de rodales semilleros para ambas especies, nicos para especies nativasde la regin, permite una regularizacin en la cosecha de semilla y la identificacin de laprocedencia de las plantaciones realizadas con ella.

Desarrollo de nuevas tecnologas para futuras lneas de investigacin

La ausencia de clusters definidos de poblaciones localizadas en una misma cuencapodra ser el resultado de un flujo gnico no tan extensivo como se esperaba en base a laubicacin de las cuencas y direccin de los vientos predominantes en la regin (oeste-este). Este resultado abre una nueva lnea de investigacin orientada a la bsqueda delas causas de un flujo gnico de menor extensin en la regin bajo estudio. Este fue unode los motivos que nos impuls a llevar adelante el trabajo en INRA, Francia de desarrolloy caracterizacin de marcadores SSRs (simple sequence repeats) para el gneroNothofagus. Las caractersticas de hipervariables y codominantes revisten a los SSRs degran utilidad en lo que respecta a estudios de flujo gnico y paternidad. Esta sera unanueva lnea de investigacin que se abre, a nuestro entender, a partir del desarrollo delpresente trabajo. Tambin se incursion en la aplicacin de otros marcadoreshipervariables, los ISSR, cuya aplicacin abre tambin numerosas lneas de trabajo.

Teora evolutiva

Se reafirm la teora evolutiva postglacial de ambas especies, con la confirmacin de laexistencia de refugios glaciarios mltiples. Los resultados de ADN de cloroplasto eisoenzimas en ambas especies sugieren la permanencia de las mismas en refugios tantocosteros como en el sector andino. Ms an, la mayor diversidad gentica observadahacia el este, en Argentina, apoyan fuertemente la hiptesis de refugios en dicha regin.Esta conclusin se refuerza tambin con la presencia de alelos exclusivos en la poblacinen la cabecera este de la cuenca del Lago Quilln. El fundamento terico de estaconclusin reside en que una mayor distancia de colonizacin a partir del refugio serelaciona con una mayor probabilidad de prdida de tipos genticos (Comps et al., 2001).Los resultados en lo que respecta a la historia evolutiva de la especie significan no slo unaporte al conocimiento bsico, sino que esta informacin en conjunto con la obtenida apartir de los estudios isoenzimticos servir de herramienta para la formulacin deprescripciones silvcolas y de conservacin.

Se generaron conocimientos tendientes a completar el modelo de hibridacin entre lasdos especies que fuera desarrollado por Gallo (2002). Este conocimiento es defundamental importancia dado el rol central de la hibridacin en procesos de especiacin.

Formacin de Recursos Humanos

El proyecto contribuy a la finalizacin de una tesis doctoral iniciada previamente y alinicio de dos tesis doctorales que se encuentran en desarrollo.

67

ACTIVIDADES DE COORDINACIN Y DIFUSIN

Reunin de Coordinacin del proyectoINIA Quilamapu. Chilln, Chile e INTA Bariloche

Durante el mes junio del 2000 y mayo del 2002 se realizaron dos reuniones deCoordinacin del proyecto en el Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA), CentroRegional (CRI) Quilamapu, ubicado en la ciudad de Chilln, Chile y en el INTA Bariloche,Argentina.

Los objetivos de estas reuniones fueron:

a) Reunir a todos los investigadores y profesionales participantes del proyecto paradiscutir los avances y fijar las estrategias de desarrollo futuro;

b) Conocer las actividades de investigacin que estn realizando los investigadoresparticipantes en Nothofagus y las polticas de conservacin y/o manejo de bosquenativo que propician sus instituciones.

Principales resultados de la reunin de coordinacin

A. Generales

Los resultados de la reunin fueron muy buenos ya que permiti conocer:1. La investigacin que est realizando el INTA e INIA en estas especies de Nothofagus2. Conocer los resultados de los proyectos de mejoramiento gentico que ha estado

desarrollando el Instituto Forestal y el INTA, y algunas experiencias preliminares en laproduccin de plantas de roble y raul

3. Conocer la poltica de conservacin de recursos forestales que est proponiendo laCorporacin Nacional Forestal (CONAF) para Chile.

B. Relacionados directamente con el proyecto

1. Discutir los avances realizados en la colecta de roble y raul en Chile y Argentina2. Revisar el avance actual y el desarrollo futuro de la Carta Gantt del proyecto3. Acordar futuros compromisos de intercambio de metodologas, informacin tcnica y

material gentico4. Intercambiar ideas sobre futuros proyectos relacionados con esta materia

Publicaciones enviadas a revistas cientficas

MARCHELLI, P; GALLO, L A. The role of glaciation, fragmentation and hybridization inshaping the distribution of the genetic variation in a Patagonian southern beech.Enviado a Journal of Biogeography.

Publicaciones de carcter cientfico en preparacin

MARCHELLI, P; GALLO, L A. Multiple ice-age refugia in a southern beech of SouthAmerica as evidenced by chloroplast DNA markers.

AZPILICUETA, M.M; GALLO, L A. Genetic variation within and between populations ofsouthern beech Nothofagus obliqua in Argentina.

68

Presentaciones a Congresos

CREGO, M. P.; GALLO, L.A., 2002. Local dynamic of interspecific hybridizationbetween two southern beeches (Nothofagus spp.). In: Abstracts of Dygen Conference"Dynamics and Conservation of Genetic Diversity in Forest Ecosystems", December 2-5, Strasbourg, France, page 108.

MARCHELLI, P.; AZPILICUETA, M.M.; GALLO, L., 2002. Joint analysis of post-glacialmigration in two southern beeches (Nothofagus spp.). In: Abstracts of DygenConference "Dynamics and Conservation of Genetic Diversity in Forest Ecosystems",December 2-5, Strasbourg, France, page 157.

MARCHELLI, P.; GALLO, L.A., 2002. Patrones de diferentes niveles de variacingentica en poblaciones naturales de Raul (Nothofagus nervosa). En: Actas XXXICongreso Argentino de Gentica, La Plata, 17-20 de septiembre, pg. 136.

AZPILICUETA, M.M.; GALLO, L.A., 2002. Variacin gentica alozmica comoherramienta de diagnstico para la conservacin e interpretacin evolutiva de losbosques de Nothofagus obliqua (Mirb.) Oerst. en Argentina. En: Actas XXXI CongresoArgentino de Gentica, La Plata, 17-20 de septiembre, pg. 135.

CREGO, M.P.; GALLO, L. A., 2002. Variacin temporal en la hibridacin natural entreNothofagus nervosa Raul (Phil.) Dim. et. Mil. y Nothofagus obliqua, Roble Pelln(Mirb.) Oerst. En: Actas XXXI Congreso Argentino de Gentica, La Plata, 17-20 deseptiembre, pg. 136.

MARCHELLI, P.; GALLO, L.A., 2001. Variacin temporal en el sistema deapareamiento de Nothofagus nervosa. En: Actas XXX Congreso Argentino deGentica, IV Jornadas Argentino Uruguayas de Gentica, Mar del Plata, 16-19 deseptiembre, pg. 146.

AZPILICUETA, M.M.; GALLO, L.A., 2001. Anlisis de la variacin gentica enNothofagus obliqua (Mirb.) Oerst. a travs de marcadores gnicos isoenzimticos. En:Actas XXX Congreso Argentino de Gentica, IV Jornadas Argentino Uruguayas deGentica, Mar del Plata, 16-19 de septiembre, pg. 147.

Participaciones en libros de carcter tcnico

Donoso, C. , Gallo, L.A., Azpilicueta, M.M. y otros: Variacin gentica en Roble Pelln.Libro sobre variacin gentica de especies forestales nativas. Donoso, Ipinza, Gallo,Premoli, Eds. (En prensa).

Donoso, C. , Gallo, L.A., Marchelli, P y otros: Variacin gentica en Raul. Libro sobrevariacin gentica de especies forestales nativas. Donoso, Ipinza, Gallo, Premoli,Eds. (En prensa).

Paredes, M.; Becerra, V.; Gallo, L.; Moreno, G. 2000. Aplicaciones potenciales de labiotecnologa al estudio de Nothofagus spp. En: R. Ipinza, B. Gutirrez, V. Emhart(eds). Domesticacin y mejora gentica de roble y raul. Universidad Austral/InstitutoForestal. pp. 419-434.

69

Informes de solicitud de reas protegidas

Informe Poblacin Pilolil, Nothofagus obliqua elevado a la Cmara Legislativa de laProvincia del Neuqun, 15 abril de 2002.

Elevacin de informe de solicitud de cambio de estatus de proteccin del rea HuaHum-Boquete, entre las cabeceras Oeste de los lagos Lcar y Lolog en funcin a losdatos de diversidad gentica obtenidos en el proyecto. Elevado el 6 de diciembre del2002 con el N 2518. Gestin en trmite.

Asistencia a seminarios, simposium

Conservacin de diversidad gentica de los recursos forestales nativos: clave para eldesarrollo sustentable.

Simposio Internacional Desarrollando el Eucalipto del Futuro organizado por laInternational Union of Forestry Research Organization (IUFRO), Valdivia, Chile.Seminario Investigacin y desarrollo en Biotecnologa silvoagropecuaria: situacinactual chilena. CONICYT-CORFO-FIA-MINECON, Santiago, Chile.

Visita experto internacional a Chilln

Debido a la importancia del tema de propagacin de plantas se invit a un expertointernacional en el tema para que nos asesorara en el desarrollo de las tcnicasactuales y futuras en este tema. el experto internacional Dr. Dagoberto Castro visitnuestro pas, profesor de la Universidad Catlica de Oriente, Ro Negro (Antioquia),Colombia realiz en nuestro pas varias actividades: a) asesoramiento en ellaboratorio de biotecnologa del CRI Quilamapu (INIA) en tcnicas de propagacin deplantas de especies nativas; b) conferencia sobre sistemas de propagacin de plantasa una audiencia de 80 profesionales, tcnicos y estudiantes forestales en la ciudad deConcepcin, Chile; y c) visita a laboratorio de propagacin de plantas a ForestalMininco S.A.

Difusin del proyecto a autoridades y profesionales.

Durante el ao se recibi un nmero importante de visitas: autoridades nacionales yprofesionales nacionales y extranjeros al Laboratorio de Biotecnologa, a quienes se lesdio a conocer los objetivos y avance del proyecto.

Seminario Final del proyecto

El 25 de junio se realiz el Seminario final del proyecto en el INIA Quilamapu. A esteseminario asistieron autoridades regionales y locales y 80 profesionales tcnicos delsector pblico y privado. En el seminario se presentaron en la maana: aspectosrelacionados con el proyecto como son la importancia econmica de las especies,situacin silvcola de ellas, visin de la empresa privada y su visin hacia este recurso,conservacin y mejoramiento genetico de estas especie. En la tarde, se presentaron losaspectos mas relevantes del proyecto como la colecta, y plantacin de ensayos deprogenie, estudios de variabilidad isoenzimtico y molecular en las dos especies y untrabajo sobre introgresin entre roble y raul. Se termin esta actividad con un resumen ydiscusin de los aspectos mas relevantes y algunas ideas de trabajo hacia el futuro.

70

BIBLIOGRAFIA

BEAVER, J.A.; IEZZONI, A.F. ; RAMM, C.M. 1995. Isozyme diversity in sour, sweet, andground cherry. Theor Appl Genet 90:847-852

CERVERA, M. T.; PLOMION, C.; MALPICA, C. 2000. Molecular markers and genomemapping in woody plants. In: Molecular Biology of Woody Plants, Vol.1, 375-394. S MJainard, S M Minocha Eds. Kluwer Academic Publishers. The Netherlands.

COMPS B, GMRY D, LETOUZEY, J.; PETIT, J. R. 2001. Diverging trends betweenheterozygosity and allelic richness during postglacial colonization in the Europeanbeech. Genetics 57: 389-397.

DELMASTRO, R. 1997. Informe de gentica forestal. Proyecto CONAF PNUD FAO.Facultad de Ingeniera Forestal, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

DONOSO, C. 1979a. Variacin y tipos de diferenciacin en poblaciones de roble(Nothofagus obliqua (Mirb.) Oerst.). Bosque 3(1):1-14.

DONOSO, C. 1994. Arboles Nativos de Chile. Gua de Reconocimiento. Marisa CneoEdiciones, Valdivia. 116 p.

DONOSO, C.; CABELLO, A. 1978. Antecedentes fenolgicos y de germinacin deespecies leosas chilenas. Ciencias Forestales 1: 31-42.

DONOSO, C.; MORALES, J.; ROMERO, M. 1990. Hibridacin natural entre roble(Nothofagus obliqua (Mirb.) Oerst.) y raul (Nothofagus alpina (Poepp. et Endl.)Oerst.) en bosques del sur de Chile. Rev. Chilenea de Hist. Nat. 63:49-60

DEMESURE, B.; SODZI, N.; PETIT, R. J. 1995. A set of universal primers for amplification ofpolymorphic noncoding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants.Molecular Ecology 4: 129-131.

DUMOLIN, S., DEMESURE, B.; PETIT, R. J. 1995. Inheritance of chloroplast andmitocondrail genomes in pedunculate oak investigated with an efficient PCR method.Theor Appl Genet, 91: 1253-1256.

DUMOLIN-LPEGUE, S.; PEMONGE, M. H.; PETIT, R. J. 1997. An enlarged set ofconsensus primers for the study og organelle DNA in plants. Mol. Ecol. 6: 393-397.

GALLO L, MARCHELLI, P.; BREITEMBCHER, A. 1997. Morphological and allozymicevidence of natural hybridization between two Southern beeches (Nothofagus spp)and its relation to heterozygosity and height qrowth. Forest Genetics 4 (1): 15-23.

GALLO, L.; MARCHELLI, P.; CREGO, P.; OUDKERK, O.; IZQUIERDO, F.,BREITEMBUCHER, A.; GONZLEZ-PEALOZA, M.; CHAUCHARD, L.; MARESCA,L.; MELE, U. 2000. Distribucin y variacin gentica en caractersticas seminales yadaptativas de poblaciones y progenies de raul en Argentina. In: R. Ipinza,Gutirrez, B., V. Emhart (eds). Domesticacin y mejora gentica de roble y raul.Universidad Austral de Chile/Instituto Forestal. pp. 133-155.

GREGORIUS, H. R. 1974. On the concept of genetic distance between populations basedon gene frequencies. IUFRO Meetings, Stockholm, S.02.04.1-3: 17-26.

71

GREGORIUS, H. R,; ROBERDS, J. H. 1986. Measurement of genetical differentiationamong subpopulations. Theor. Appl. Genet. 71, 826-834.

GURIES R.P. ; LEDIG, T. 1982. Genetic diversity and population structure in pitch pine(Pinus rigida Mill). Evolution 36:387

HAASE, P. 1993. Isozime studies of New Zealand Nothofagus species (southern beech)using leaf extracts. Silvae Genetica 42:46-51.

IPINZA, R; GUTIRREZ, B.; MEDINA, A; MORENO, P.; EMHART, V. 2000. Anlisisgeogrfico y gentico de rasgos morfolgicos de la semilla, germinacin ycrecimiento inicial en N. alpina y N. obliqua. En: Reunin Internacional "Modelos yMtodos Estadsticos Aplicados a Bosques Naturales". Valdivia, Chile.

KAMPFER, S.; LEXER, C.; GLSSL, J.; STEINKELLNER, H. 1998. Characterization of(GA)n microsatellite loci from Quercus robur. Hereditas 129: 183-186.

KERTADIKARA, A.W.S. ; PRAT, D. 1995. Isozyme variation among teak (Tectona grandisL.f.) provenances. Theor Appl Genet 90:803-810

LOUKAS, M.; VERGINI, Y. ; KRIMBAS, C.B. 1983. Isozyme variation and heterozygosity inPinus halepensis L. Biochemical Genetics. 21: 497-509

MARCHELLI, P.; GALLO, L.; SCHOLZ, F.; ZIEGENHAGEN, B. 1998. Chloroplast DNAmarkers reveal a geographical divide across Argentinean southern beech Nothofagusnervosa (Phil.) Dim. et Mil. distribution area. Theor. Appl. Genet. 97: 642-646.

MARCHELLI, P.; GALLO, L. A. 1999. Annual and geographic variation in seeed traits ofArgentinean populations of southern beech Nothofagus nervosa (Phil.) Dim. Et Mil..Forest Ecology and Management 121: 239-250.

MARCHELLI, P.; GALLO, L. A. (2000) Genetic analysis of isozyme variants in openpollinated families of Southern beech Nothofagus nervosa (Phil.) Dim. et Mil. SilvaeGenetica, 4: 90-98.

MTYS, G.; SPERISEN, C. 2001. Chloroplast DNA polymorphisms provide evidence forpostglacial re-colonisation of oaks (Quercus spp.) across the Swiss Alps. Theor. Appl.Genet. 102: 12-20.

OUAZZANI, N. ; LUMARET, R. ; VILLEMUR, P. ; DI GIUSTO, F. 1993. Leaf isozymevariation in cultivated and wild olive trees (Olea europea L.) J. Hered. 94:34-42

PINEDA, G. 2000. Variabilidad isoenzimtica del huerto semillero clonal de N. alpina. In: R.Ipinza, Gutirrez, B., V. Emhart (eds). Domesticacin y mejora gentica de roble yraul. Universidad Austral de Chile/Instituto Forestal. pp. 95-119.

STAVRAKAKIS, M.; LOUKAS, M. 1983. The between and within grape cultivars geneticvariation. Scientia Horticulturae 19:421-334

STEINKELLNER, H.; FLUCH, S.; TURETSCHEK, E.; LEXER, C.; STEIFF, R.; KREMR A.;BURG, K.; GLSSL, J. 1997. Identification and characterization of (GA/CT)n microsatellite loci from Quercus petraea. Plant Molecular Ecology 33: 1093-1096.

72

TABERLET, P.; GIELLY, L.; BOUVET, J. 1991. Universal primers for amplification of threenon-coding regions of chloroplast DNA. Plant Mol. Biol. 17: 1105-1109.

TAKAHASHI, M.; TSUMURA, Y.; NAKAMURA, T. ; UCHIDA, K. ; OHBA, K. 1994. Allozymevariation of Fagus crenata in northeastern Japan. Can.J.For.Res. 24:1071-1074

TANSKLEY, S.D. ; YOUNG, N.D. ; PAT, A.H. ; BONIERBALE, M.W. 1989. RFLP mapping inplant breeding- new tools for an old science. Bio/Technology 7 :257-254

TIGERSTEDT, P.M.A. 1973. Studies on isozyme variation in marginal and centralpopulations of Picea abies. Hereditas 75:47

VERGARA, R.; IPINZA, R.; DONOSO, C.; GROSSE, H. 1998. Definicin de zonas deprocedencias de roble (Nothofagus obliqua (Mirb.) Oerst.) y raul (Nothofagus alpina(Poep. et Endl.) Oerst.). En: Primer Congreso Latinoamericano IUFRO, El ManejoSustentable de los Recursos Forestales, Desafo del siglo XXI. Valdivia 22 al 28 denoviembre de 1998.

VERGARA, R.; BOHLE, K. 2000. Estado actual del recurso forestal de N. alpina y N. obliquaen Chile. In: R. Ipinza, Gutirrez, B., V. Emhart (eds). Domesticacin y mejoragentica de roble y raul. Universidad Austral de Chile/Instituto Forestal. pp. 43-52.

WELSH, J. ; McLELLAND, M. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitraryprimers. Nucleic Acids Res 18 :7213-7218

WILLIAMS, J.G.K. ; KUBELIK, A.R. ; LIVAK, K.J. ; RAFALSKI, J.A. ; TINGEY S.V. 1990.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.Nucleic Acid Res 18 : 6531-6535

ZOBEL, B y TALBERT, J. 1984. Applied forest tree improvement. John Willey and Sons,Inc., New York. 505 p.

73

ANEXOS

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

97

98

99

100

101

102

103

104

105

106

107

108

109

110

111

112

113

114

115

116

117